包鴻慧，候鳳蒙，劉志明，周 睿，曹龍奎，愈商權(quán)

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319;2.韓國(guó)江陵原州大學(xué)海洋生物科技學(xué)院，韓國(guó)，江源江陵210－702)

真姬菇又名蟹味菇、玉蕈、鴻禧菇等，其味比平菇鮮，肉比滑菇厚，質(zhì)比香菇韌，口感極佳，還具有獨(dú)特的蟹香味，在日本有“香在松茸、味在玉蕈”之說(shuō)，是一種著名國(guó)際性藥食兼用的珍稀食用菌，具有防止便秘、抗癌、防癌、提高免疫力、預(yù)防衰老、延長(zhǎng)壽命等獨(dú)特功效［1］。真菌多糖普遍都具有潛在的抗癌和免疫活性，而且其生物活性與分子結(jié)構(gòu)有著非常密切的關(guān)系，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)鑒定和抗癌免疫活性的研究是非常重要的［2］。真姬菇自20世紀(jì)80年代從日本引種至我國(guó)，目前我國(guó)已掌握了真姬菇生物學(xué)特性和栽培條件，真姬菇已成為我國(guó)食用菌工廠化生產(chǎn)的重要品種之一。然而我國(guó)由于引進(jìn)真姬菇較晚，故對(duì)其研究尚不深入。目前國(guó)內(nèi)大多針對(duì)真姬菇的生物學(xué)特性、栽培工藝、液態(tài)發(fā)酵條件、營(yíng)養(yǎng)成分及加工工藝等方面進(jìn)行研究。而對(duì)真姬菇多糖的研究，國(guó)內(nèi)自2007年才見(jiàn)報(bào)道，并且大部分是對(duì)粗多糖提取工藝的研究［3－7］。目前國(guó)內(nèi)對(duì)真姬菇相應(yīng)的藥理活性研究也主要針對(duì)粗多糖，且僅限于抗氧化活性［8］和抑菌活性［9］。本文提取分離純化真姬菇多糖，并對(duì)純化后的真機(jī)菇多糖進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)特性鑒定和抗癌免疫活性的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

真姬菇 購(gòu)于上海大山合菌物科技股份有限公司;醋酸纖維素膜 英國(guó)沃特曼公司產(chǎn)品;葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖 Fluka公司;DEAE sepharose fast flow離子交換樹脂 Phamacia公司產(chǎn)品;胎牛血清、RPMI－1640培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司;水溶性四唑鹽(WST－1)瑞士Roche公司;Raw 264.7細(xì)胞、人胃腺癌細(xì)胞(AGS)、結(jié)腸腺癌細(xì)胞(DLD－1)、子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

高效液相色譜(配置2414示差折光檢測(cè)器)美國(guó)Waters公司;Bruker Agilent 6890N氣譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司;十八角激光光散射儀及ASTRA 5.3工作站 美國(guó)Wyatt技術(shù)公司;EL－800酶聯(lián)檢測(cè)儀 美國(guó)BioTek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 真姬菇子實(shí)體粉的預(yù)處理 去雜、烘干(60℃，24h)、粉碎、過(guò)篩(100 目)、備用(－20℃)。

1.2.2 真姬菇子實(shí)體多糖的提取純化 稱取真姬菇子實(shí)體粉末100g，加入80%乙醇，于60℃水浴回流脫脂2h，殘?jiān)屑舆m量水(水料比1∶20)，100℃水浴提取2次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液，加入氯仿－正丁醇(4∶1)，充分震蕩 30min，5000r/min 離心 20min，取上層水相重復(fù)除蛋白10次以上，取上清液裝入透析袋內(nèi)，先用自來(lái)水流動(dòng)透析48h，再用蒸餾水透析24h后，濃縮，真空冷凍干燥，即得真姬菇粗多糖(HMP)。

溶解真姬菇多粗糖HMP，上樣后分別用蒸餾水及不同濃度NaCl溶液洗脫，流速1.5mL/min。收集洗脫液(30min/管)，用硫酸苯酚法檢測(cè)［10］，合并相同流分，濃縮，透析，真空冷凍干燥，得不同多糖級(jí)分。

1.2.3 真姬菇子實(shí)體多糖的均一性和平均分子質(zhì)量的測(cè)定 采用高效分子排阻色譜法(HPSEC)對(duì)真姬菇多糖進(jìn)行均一性及分子質(zhì)量的測(cè)定。溶解多糖，醋酸纖維素膜(3.0μm pore size)過(guò)濾，注入高效凝膠尺寸排阻色譜－十八角激光散色儀－示差檢測(cè)儀聯(lián)用(HPSEC－MALLS－RI)系統(tǒng)，高效凝膠排阻色譜為三個(gè)色譜柱串聯(lián):TSK G5000 PW(7.5×600 mm)、TSK G3000 PWxl(7.8×300mm)、TSK G2500PWxl(7.8×300mm)，流動(dòng)相:0.15mol/L NaNO3和 0.02%NaN3，流速:0.4mL/min。多糖的平均分子量可根據(jù)MALLS和RI檢測(cè)器收集的數(shù)據(jù)，通過(guò)ASTRA 5.3軟件直接計(jì)算。

1.2.4 單糖含量測(cè)定 稱取5mg真姬菇子實(shí)體多糖于安培瓶中，加入2mol/L三氟乙酸(TFA)2mL，120℃水解2h后，水解液減壓濃縮至干，再加甲醇3mL蒸干，重復(fù)3次，除盡TFA。加入適量水溶解，水解產(chǎn)物經(jīng)0.45μm微孔膜過(guò)濾后，取濾液20μL注入HPLC系統(tǒng)測(cè)定進(jìn)行測(cè)定，糖分析色譜柱(4.6×250mm)，流動(dòng)相為乙腈與水混合物(80∶20)，流速2mL/min。

1.2.5 糖苷鍵連接方式分析 多糖2～3mg，0.5mL DMSO溶解后，加入0.3mL的CH3I和NaOH(20mg)進(jìn)行甲基化，經(jīng)4mol/L的 TFA水解(100℃，6h)，NaBD4還原，醋酸酐乙?；螅苌镒⑷霘庀嗌V－質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS)檢測(cè)。GC－MS色譜柱為HP－5柱(30m ×0.25mm，0.25μm)，程序升溫條件:初始溫度/停頓時(shí)間為160℃/2min，程序升溫終止溫度/停頓時(shí)間240℃/10min，升溫速率5℃/min。

1.2.6 對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃腺癌細(xì)胞(AGS)、結(jié)腸腺癌細(xì)胞(DLD－1)、子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)，于RPMI－1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基中，以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后吸取上清液棄去，用磷酸緩沖液(PBS)洗1～2遍，加入不含小牛血清的濃度分別為10、100、500、1000μg/mL 真姬菇多糖樣品，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，加入 20μL WST－1，培養(yǎng) 4h，450nm 下測(cè) OD 值，按以下公式計(jì)算癌細(xì)胞抑制率:

其中 As是實(shí)驗(yàn)組 OD值，Ac是空白對(duì)照組OD值。

1.2.7 真姬菇多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖作用 在96孔培養(yǎng)板中加入巨噬細(xì)胞 Raw 264.7(100μL，1×105個(gè)/mL;ATCC，Rockville，MD，USA)和濃度為 12.5、25、50、100 μg/mL 的多糖溶液(100μL)，在 CO2培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng) 72h，RPMI－1640(含 10% 胎牛血清)為培養(yǎng)基?？瞻讓?duì)照加生理鹽水。增殖作用采用WST－1法，按以下公式計(jì)算免疫細(xì)胞增殖率:

其中 As是實(shí)驗(yàn)組 OD值，Ac是空白對(duì)照組OD值。

1.2.8 真姬菇多糖對(duì)巨噬細(xì)胞NO釋放的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄掉培養(yǎng)上清，加入多糖溶液或LPS(1μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照)。培養(yǎng)24h，分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清(100μL)，與等體積的Griess試劑混合，避光反應(yīng)10min，酶標(biāo)儀540nm測(cè)吸收值。NO濃度參考NaNO2(1～200μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，應(yīng)用SAS8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯氏復(fù)極差(Duncan’s multiple－range test)法分析比較各實(shí)驗(yàn)組之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 真姬菇多糖HMP－3的分離純化

真姬菇子實(shí)體粉末經(jīng)水提取、醇沉、Sevag法脫蛋白得真姬菇子實(shí)體粗多糖(HMP)，HMP進(jìn)一步經(jīng)DEAE－Sepharose Fast Flow離子交換柱分離純化，DEAE－Sepharose Fast Flow不僅具有離子交換功能，還具有較快的洗脫速度和良好的分子篩效應(yīng)，對(duì)真姬菇多糖的洗脫曲線如圖1所示，該粗多糖被分離為三個(gè)組分，將洗脫液濃縮、透析、冷凍干燥得白色絮狀多糖 HMP－1、HMP－2、HMP－3，其中 HMP－1 和HMP－2較少，HMP－3為主要組分，對(duì)HMP－3進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)和生物活性的研究。

表1 各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC洗脫信息Table 1 HPLC elution information of standard monosaccharides

表2 HMP－3中單糖HPLC洗脫信息Table 2 HPLC elution information for monosaccharides of HMP－3

表3 HMP－3的GC－MS甲基化分析結(jié)果Table 3 Methylation analysis of HMP－3

圖1 真姬菇多糖的DEAE－Sepharose Fast Flow色譜分離曲線Fig.1 Elution pattern of polysaccharides from Hypsizigus marmoreus on DEAE－Sepharose Fast Flow chromatography

2.2 HMP－3的均一性及分子量測(cè)定

多糖的純度不能以通常小分子化合物的純度標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量，它是一種生物高分子化合物，其存在微觀的不均一性。真姬菇多糖HMP－3的均一性及分子質(zhì)量采用高效分子排阻色譜法(HPSEC)進(jìn)行分析。從RI色譜圖可知(圖2)，HMP－3在HPSEC上得到一個(gè)單一對(duì)稱峰，說(shuō)明HMP－3為均一多糖組分。經(jīng)MALLS技術(shù)測(cè)定HMP－3的平均分子量(Mw)為(7460±110)ku。HMP－3的回旋半徑值(Rg)也通過(guò)MALLS計(jì)算出來(lái)以評(píng)估其分子尺寸，為(21.6±0.4)nm。從不同蘑菇中提取的水溶性多糖分子質(zhì)量之間差異比較大，從1.1 ×104g/mol到 3.9 ×107g/mol不等［11－12］，這種巨大的差異不僅是由于蘑菇種類不同，也與提取純化方法，分析檢測(cè)技術(shù)及蘑菇所處的生長(zhǎng)周期不同有關(guān)。

圖2 RI檢測(cè)儀檢測(cè)的HMP－3分子排阻色譜圖Fig.2 HPSEC chromatograms of HMP－3 from RI detector

2.3 單糖組成

HMP－3完全水解物與標(biāo)準(zhǔn)單糖的HPLC洗脫信息(表2、表3)對(duì)照表明:HMP－3由葡萄糖和半乳糖兩種單糖組成。經(jīng)面積歸一法計(jì)算兩種單糖含量得:葡萄糖的含量為80.18mg/g;半乳糖的含量為10.82mg/g。從菌核側(cè)耳和平菇中提取的水溶性多糖也主要由葡糖糖(含量為73.1%～97.0%)和半乳糖(0.5% ～14.3%)組成［13－15］，其他單糖如果糖、木糖、甘露糖等在本研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。

2.4 糖苷鍵連接方式分析

HMP－3經(jīng)甲基化，酸水解、還原及乙?；?，生成甲基化糖醇乙酸酯衍生物，對(duì)其進(jìn)行GC－MS分析，總離子圖(TIC)如圖3所示，質(zhì)譜電離方式為EI源。

甲基化產(chǎn)物的GC－MS分析結(jié)果(表3)顯示，甲基化糖醇衍生物中占絕大部分的為2，3，6－Me3－Glcp，這說(shuō)明多糖HMP－3分子的主鏈可能主要是通過(guò)1，4糖苷鍵連接的葡糖糖組成。一種經(jīng)DEAE－纖維素柱層析純化的真姬菇多糖HPS－II也以(1，4)葡聚糖為主鏈，與我們的研究結(jié)果一致，雖然我們的純化方法不盡相同［16］。同時(shí)由于衍生物中也有相當(dāng)一部分的2，3，4－Me3－Glcp和2，3，4－Me3－Galp，說(shuō)明其主鏈也包含了1，6糖苷鍵連接的葡萄糖或者半乳糖。在真姬菇同屬的菌核側(cè)耳和環(huán)柄側(cè)耳多糖也由(1，4)葡萄糖構(gòu)成主鏈，同時(shí)包含(1，6)葡萄糖或者半乳糖分支，與我們?cè)谘芯堪l(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)相似［17－18］。

表4 HMP－3對(duì)人細(xì)胞株的體外抑制作用Table 4 Anti－proliferative activity of HMP－3 in AGS cell lines

圖3 HMP－3的總離子流圖譜Fig.3 Chromatogram of HMP－3 on GC－MS total ion flow

2.5 抗癌活性測(cè)定

HMP－3 對(duì) AGS、DLD－1、HeLa癌細(xì)胞的體外抑制率見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，HMP－3對(duì) AGS、DLD－1、HeLa的抑制率相對(duì)比較低(＜20%)而且無(wú)劑量依賴性。說(shuō)明HMP－3對(duì)這三種癌細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。Ikekawa等人也曾報(bào)道過(guò)體外實(shí)驗(yàn)中真姬菇粗多糖對(duì)L－5178Y腫瘤細(xì)胞幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性［19］，與我們的研究結(jié)果吻合。菌核側(cè)耳多糖和香菇多糖也對(duì)Sarcoma 180細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞(HepG2)的體外抑制率(11% ～28%)較低［20－21］。然而，盡管體外抗癌活性低，真姬菇粗多糖和金福菇多糖在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了高抗癌活性［19，22］。對(duì)于這些多糖為什么只在體內(nèi)表現(xiàn)抗癌活性，目前機(jī)理并不明確，然而有跡象表明多糖可能是作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，通過(guò)刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生一氧化亞氮(NO)或者細(xì)胞因子來(lái)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［19，23］。

2.6 真姬菇多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖作用

小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7在LPS的刺激下會(huì)釋放細(xì)胞因子，這一系統(tǒng)被用于測(cè)定某種成分是否對(duì)免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)活性［24］。因此，本實(shí)驗(yàn)以小鼠巨噬細(xì)胞 Raw264.7為細(xì)胞模型，考查了 HMP－3對(duì)Raw264.7細(xì)胞增殖及NO生成的影響，為活性多糖的免疫調(diào)節(jié)研究提供有價(jià)值的參考模式。本實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，含有HMP－3(1～200μg/mL)的培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)基顏色清澈，細(xì)胞透亮，長(zhǎng)勢(shì)良好。WST－1結(jié)果(圖4)表明，HMP－3可促進(jìn)Raw264.7細(xì)胞的增殖，HMP－3對(duì)Raw264.7無(wú)細(xì)胞毒作用。

圖4 HMP－3對(duì)Raw264.7增殖率的影響Fig.4 Effect of HMP－3 on cell proliferation of Raw264.7 cells.

2.7 真姬菇多糖對(duì)巨噬細(xì)胞NO釋放的影響

HMP－3對(duì)Raw264.7細(xì)胞中NO釋放的影響如圖5所示，由結(jié)果可知，巨噬細(xì)胞在不添加任何成分，也就是在靜息狀態(tài)下，釋放的NO很少。添加HMP－3后，Raw264.7分泌NO的能力明顯提高(p＜0.01)，生成的NO的量隨HMP－3劑量的增加而增加，呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)HMP－3在濃度為15μg/mL時(shí)，Raw264.7生成 NO的量為 33.51μmol/L，與 LPS中Raw264.7生成NO的量相似。NO水平是巨噬細(xì)胞激活的一個(gè)重要指標(biāo)，巨噬細(xì)胞抗病毒、抗腫瘤、抑制胞內(nèi)病原體增殖等作用主要都是通過(guò)釋放NO實(shí)現(xiàn)［25］。HMP－3顯著增加了巨噬細(xì)胞釋放NO的能力，說(shuō)明HMP－3是巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)活性。

圖5 HMP－3對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7中NO的影響Fig.5 Effect of HMP－3 on NO production in mouse peritoneal macrophage Raw264.7 cells

3 結(jié)論

從真姬菇中提取生物活性成分真姬菇多糖，經(jīng)離子交換柱層析分離純化得到組分HMP－3;HMP－3主要由葡萄糖和半乳糖構(gòu)成，相對(duì)分子量為(7460±110)ku，分子回旋半徑值為(21.6±0.4)nm;經(jīng)甲基化和GC－MS初步分析其結(jié)構(gòu)，HMP－3主鏈主要由(1，4)葡萄糖構(gòu)成，含有少量(1，6)葡萄糖或(1，6 半乳糖);體外實(shí)驗(yàn)表明，HMP－3雖對(duì) AGS、DLD－1和HeLa癌細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，但對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞有強(qiáng)烈的激活作用，具有免疫活性，可以作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于醫(yī)藥、衛(wèi)生或者保健食品中。

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