劉妍妍，劉茗飛，高薇，張麗萍

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130022）

離子交換色譜法分離純化胸腺肽α1的工藝研究

劉妍妍1，2，劉茗飛1，高薇1，張麗萍1，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130022）

摘 要：通過(guò)對(duì)胸腺肽α1的分離純化，提高胸腺肽α1的純度，確定簡(jiǎn)單可行的純化工藝技術(shù)。將QAE Sephadex A-25和D208、D301、717等陰離子交換介質(zhì)進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，確定最適離子交換介質(zhì)；通過(guò)L9（33）正交試驗(yàn)對(duì)流速、填料高度及進(jìn)樣濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳分離條件。以QAE Sephadex A-25作為填料介質(zhì)吸附胸腺肽α1，在流速60 cm/h，填料高度50 cm，進(jìn)樣濃度8 mg/mL條件下，胸腺肽α1純化效果理想，經(jīng)HPLC測(cè)定，得到純度達(dá)24.596 6 mg/mL的胸腺肽α1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)12.03%，比市場(chǎng)上銷(xiāo)售的胸腺肽中Tα1含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%～1.0%）高出近10倍。

關(guān)鍵詞：胸腺肽α1，離子交換色譜，分離純化

胸腺肽是胸腺組織上皮細(xì)胞分泌的分子量在10 000 u以下的多肽激素[1]，是一種重要的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。它廣泛地存在于脊椎動(dòng)物的組織中，例如牛、豬、羊、鼠以及人類(lèi)，在它們的胸腺、脾、心臟、肝臟中分布，其中要屬胸腺中含量最高[2]。胸腺肽中活性最高的多肽為胸腺肽α1（thymosin α1）又簡(jiǎn)稱Tα1，具有較高的免疫增強(qiáng)活性，同時(shí)還具有刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、促進(jìn)血管生成和傷口愈合等作用，已用于乙型肝炎、丙型肝炎、惡性腫瘤以及免疫缺陷疾病等的臨床治療和研究中[3]。

目前，獲得高純度胸腺肽α1可以利用生物提取法、基因工程法、化學(xué)合成法三種途徑進(jìn)行生產(chǎn)，其中基因工程法具有高效表達(dá)的技術(shù)難題，尚處在實(shí)驗(yàn)室研究階段；化學(xué)合成法具有成本昂貴、污染環(huán)境等弊端；利用動(dòng)物組織提取天然胸腺肽α1價(jià)格合理，無(wú)環(huán)境污染，臨床應(yīng)用安全[4]。本實(shí)驗(yàn)采用QAE Sephadex A-25對(duì)超聲波輔助提取的胸腺肽進(jìn)行分離純化，以期可以摸索出一套分離純化胸腺肽α1的工藝技術(shù)，為今后工業(yè)化生產(chǎn)胸腺肽α1提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胸腺肽α1粗品：由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供[5]；乙腈：HPLC Grade.DIMA TECHNOLOGY INC；三氟乙酸：HPLC Grade，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲（Tris）：Ultrapure Grade，Chem Base；QAE Sephadex A-25：超細(xì)型，瑞典 Pharmacia公司；陰離子交換樹(shù)脂（D 301； 717；D208，大慶精化樹(shù)脂廠）；鹽酸（AR）：沈陽(yáng)華東試劑廠；乙酸（AR）：天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；氫氧化鈉（AR）：沈陽(yáng)新興試劑廠；Tα1標(biāo)準(zhǔn)品（邁普新，生產(chǎn)批號(hào)081002，純度10%，四川成都地奧九泓制藥廠）。

TH梯度混合器：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DYY-10C電泳儀：北京市六一儀器廠；WD-9405B水平搖床：沃德生物醫(yī)學(xué)儀器分公司；Ф1.6 cm×20 cm、Ф1.6 cm×50 cm、Ф1.6 cm×30 cm Z型層析柱：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；TU-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；PB-10 Sartorius普及型pH計(jì)：德國(guó)賽多利斯股份公司；PC-2025 HPLC System（Lab Alliance）；250 mm×4.6 mm C18硅膠柱（Lab Instrument CO.LTD）。

1.2 方法

1.2.1 電導(dǎo)率的測(cè)定

采用電導(dǎo)計(jì)按照文獻(xiàn)[6]中附錄3規(guī)范操作直接測(cè)定。

1.2.2 吸附量的計(jì)算

吸附量的計(jì)算公式：

吸附劑對(duì)胸腺肽α1吸附量（mg/mL）=（吸附前胸腺肽α1含量/mg-吸附后胸腺肽α1含量/mg）/離子交換劑體積/mL

1.2.3 HPLC檢測(cè)

從各個(gè)洗脫峰中吸取20 μL進(jìn)行HPLC測(cè)定。根據(jù)《ZGB2003-001胸腺肽溶液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，采用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatogram，HPLC）法確定胸腺肽α1的含量。

柱子類(lèi)型：C18硅膠柱，300 A；

流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸（TFA）；

流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的TFA和90%乙腈；

洗脫梯度：10%～30%流動(dòng)相B；洗脫時(shí)間：50 min；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm。

1.2.4 胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水分別配制成質(zhì)量濃度為 0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0 mg/mL 的 5 種標(biāo)準(zhǔn)溶液，在給定的色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行HPLC檢測(cè)。每份平行進(jìn)樣3次，取其平均值。以胸腺肽α1的峰面積值Y對(duì)質(zhì)量濃度X/（g/L）繪制胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立相應(yīng)的回歸方程，并應(yīng)用此方程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)中胸腺肽 α1的測(cè)定[7]。

1.2.5 陰離子交換介質(zhì)的選擇研究

實(shí)驗(yàn)中分別選擇QAE-Sephadex A-25以及陰離子交換樹(shù)脂D208、D301、717作為分離純化胸腺肽α1的離子交換介質(zhì)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)選出最合適的離子交換介質(zhì)。

1.2.6 洗脫方式的選擇

1.2.6.1 階躍式洗脫

實(shí)驗(yàn)采用 pH7.0，20 mmol/L Tris·HCl/10 mmol/L NaCl溶液、20 mmol/L Tris·HCl/30 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris·HCl/50 mmol/L NaCl溶液三種梯度濃度溶液進(jìn)行洗脫，將所收集的洗脫峰進(jìn)行含量的測(cè)定。

1.2.6.2 梯度洗脫

實(shí)驗(yàn)采用 20 mmol/L Tris·HCl，pH7.0，0～50 mmol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，將所收集的洗脫峰進(jìn)行含量的測(cè)定。

1.2.7 流速的優(yōu)化研究

實(shí)驗(yàn)選用內(nèi)徑為1.6 mm、柱高為30 cm的層析柱，設(shè)定 20、40、60、80、100、120、140、160 cm/h 等 8 個(gè)流速水平，根據(jù)不同流速下離子交換介質(zhì)對(duì)原料液吸附程度的不同，檢測(cè)穿透曲線出現(xiàn)時(shí)流出液的OD值，采用Sigma Plot9.0作圖軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，根據(jù)圖像即可選出合適的流速。

1.2.8 填料高度的優(yōu)化研究

實(shí)驗(yàn)選取的層析柱內(nèi)徑為1.6 cm，將填料高度分別設(shè)定在 10、20、30、40、50 cm 5 個(gè)水平，設(shè)定流速在80 cm/h，找出填料高度與多肽吸附程度之間的關(guān)系。

1.2.9 正交試驗(yàn)

試驗(yàn)選取流速（cm/h）、填料高度（cm）、以及進(jìn)樣濃度（mg/mL）3個(gè)因素作為考察對(duì)象，采用L9（33）正交試驗(yàn)表，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，得到濃度為1.6 mg/mL的Tα1標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜，見(jiàn)圖 1；胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為3.003 min，峰面積為91 069。

圖1 胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)品高效液相圖譜Fig.1 Chromatogram of Tα1standard sample

2.1.2 胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

胸腺肽α1的峰值Y對(duì)胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)品的濃度X（mg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

圖2 胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Tα1

2.2 陰離子交換劑的初步篩選結(jié)果

通過(guò)公式計(jì)算得出陰離子交換劑QAE-Sephadex A-25以及陰離子交換樹(shù)脂D208、D301、717對(duì)胸腺肽α1的靜態(tài)吸附量見(jiàn)表1。

表1 陰離子交換劑靜態(tài)吸附量Table 1 Results of weak anion gel static absorption

QAE Sephadex A-25凝膠吸附量最大，因此選擇QAE Sephadex A-25凝膠介質(zhì)為分離介質(zhì)，并可將717陰離子交換樹(shù)脂作為工業(yè)化分離的備選介質(zhì)。

2.3 洗脫方式的確定

階躍式洗脫結(jié)果見(jiàn)圖3所示。

由圖3可以看出，經(jīng)過(guò)陰離子交換色譜分離的胸腺肽含有約23個(gè)吸收峰，這與胸腺肽資料中敘述的幾十種多肽吻合，但其中4、5、6三個(gè)吸收峰沒(méi)有明顯分開(kāi)。

圖3 QAE Sephadex A-25梯度洗脫曲線Fig.3 The gradient elution curve of QAE Sephadex A-25

梯度洗脫結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 QAE Sephadex A-25階躍式洗脫曲線Fig.4 The step elution curve of QAE Sephadex A-25

從圖4中梯度式洗脫層析圖譜可了解到，在30 mmol/LNaCl離子強(qiáng)度洗脫下，共洗脫出19個(gè)色譜峰，其中4、5、6三個(gè)吸收峰初步洗脫分開(kāi)，從而確定階躍式洗脫方式將優(yōu)于梯度洗脫方式。同時(shí)，從層析圖譜中可以了解到胸腺肽粗品中直接分離出胸腺肽α1是有一定困難的，因此，將等電點(diǎn)沉淀所得樣品進(jìn)行陰離子交換色譜分析，以期能夠得到比較純的胸腺肽α1。

2.4 流速的優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到洗脫速度與出現(xiàn)穿透峰后流出液中蛋白濃度的關(guān)系如圖5所示。

圖5 流速與交換后溶液蛋白濃度的關(guān)系Fig.5 The relationship between velocity and absorpted

由圖5可以看出，當(dāng)流速在100 cm/h以下時(shí)，洗脫后的穿透液OD值比較低并且也比較穩(wěn)定，這說(shuō)明樣品在流速為100 cm/h以下時(shí)得到了充分的吸附；當(dāng)流速大于120 cm/h時(shí)，穿透液的OD值大幅度增加，這說(shuō)明樣品中的多肽在流速高于120 cm/h時(shí)沒(méi)有得到充分吸收，造成樣品大量浪費(fèi)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇流速低于100 cm/h。

同時(shí)，流速降低會(huì)導(dǎo)致洗脫峰面積增大，半峰寬變大，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，所以流速也不可以過(guò)低，實(shí)驗(yàn)選擇高于30 cm/h。

2.5 填料高度的優(yōu)化

在流速為80 cm/h時(shí)，填料高度與蛋白吸附程度的關(guān)系見(jiàn)圖6所示。

圖6 80 cm/h時(shí)填料高度與OD220nm之間的關(guān)系Fig.6 The relationship between column length and OD220nm at 80 cm/L

由圖6可以了解到，層析柱在流速為80 cm/h的條件下，隨著填料高度的升高OD值逐漸下降，即樣品中的多肽吸收的越來(lái)越充分；同時(shí)，OD值在50 cm的填料高度時(shí)并不穩(wěn)定，說(shuō)明在此流速下層析柱的填料高度仍要加高，僅50 cm是不能滿足要求的，即在此流速下進(jìn)行離子交換層析是不可取的。

那么確定流速為50 cm/h條件下，對(duì)填料高度與OD值的關(guān)系重新進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖7所示。

圖7 50 cm/h時(shí)填料高度與OD220nm之間的關(guān)系Fig.7 The relationship between column length and OD220nmat 50 cm/h

由圖7可知，當(dāng)層析柱流速在50 cm/h時(shí)，隨著填料高度的增加OD值在下降，說(shuō)明樣品中的多肽吸附的越來(lái)越充分；在填料高度達(dá)到30 cm時(shí)，OD值變化趨于穩(wěn)定，說(shuō)明在此時(shí)離子交換劑對(duì)樣品吸附的比較充分，所以，在流速為50 cm/h時(shí)，可確定填料高度為30 cm。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表2。

表2 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Factors and Levels of Orthogonal experiment

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)評(píng)定指標(biāo)中的胸腺肽α1含量進(jìn)行極差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 胸腺肽α1含量的極差分析Table 3 Variance analysis of Tα1

由表3中的R值的結(jié)果看出，因素A的R值最大，其次是B和C，D的R值最小。極差越大，反映該因素水平變動(dòng)時(shí)，總指標(biāo)變化越大，即該因素越重要。因此，影響胸腺肽α1含量的因素主次順序?yàn)椋篈＞B＞C，即流速＞填料高度＞進(jìn)樣濃度。

對(duì)正交試驗(yàn)評(píng)定指標(biāo)中的胸腺肽α1含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4方差分析結(jié)果顯示，此模型F值為20.31，Pr（0.0477）＜0.05，模型的 R-Square為 0.9838，說(shuō)明此模型具有意義；實(shí)驗(yàn)中3種因素對(duì)胸腺肽α1含量的影響程度各不相同，因素A（流速）的F值=54.33，Pr（0.018 1）＜0.05，說(shuō)明在α=0.05時(shí)，因素A對(duì)胸腺肽α1含量的影響達(dá)到顯著水平，因素B、C對(duì)胸腺肽α1含量的影響不顯著。

表4 正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 ANOAN（analysis of variance）of items of regression equation on Tα1

將各因素對(duì)胸腺肽α1含量的影響趨勢(shì)作直觀圖，見(jiàn)圖8。

圖8 影響胸腺肽α1含量的效應(yīng)曲線Fig.8 Effect curve of Tα1

由圖8選擇最佳工藝條件為A2B3C3組合，即流速確定為60 cm/h，填料高度為50 cm，進(jìn)樣濃度為8 mg/mL來(lái)采用QAE Sephadex A-25凝膠分離純化胸腺肽α1。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照優(yōu)化的陰離子交換色譜對(duì)等胸腺肽α1粗品進(jìn)行分離純化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)圖9。

圖9 QAE Sephadex A-25等電點(diǎn)沉淀的洗脫曲線Fig.9 The elution curve of isoelectric precipitation in QAE Sephadex A-25

由圖9可知，胸腺肽粗品經(jīng)過(guò)等電點(diǎn)沉淀后，于QAE Sephadex A-25凝膠中同樣采用階躍式洗脫分離出3個(gè)洗脫峰，說(shuō)明等電點(diǎn)沉淀除去大量的雜多肽，優(yōu)化了胸腺肽α1的分離純化工藝。

2.8 HPLC檢測(cè)結(jié)果與分析

于各個(gè)洗脫峰吸取20 μL進(jìn)行HPLC測(cè)定，測(cè)定方法參見(jiàn)2.7.7洗脫峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的HPLC色譜圖分別見(jiàn)圖10、圖11和圖12。

圖10 洗脫峰I的高效液相色譜圖Fig.10 Chromatogranm for the sample of eluting peak I

圖11 洗脫峰ⅡⅢ的高效液相色譜圖Fig.11 Chromatogranm for the sample of eluting peakⅡ

圖12 洗脫峰Ⅲ的高效液相色譜圖Fig.12 Chromatogranm for the sample of eluting peakⅢ

洗脫峰Ⅰ的保留時(shí)間為2.816 min，峰面積為1 399 778，其胸腺肽α1含量高達(dá)24.596 6mg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出市場(chǎng)上所銷(xiāo)售的胸腺肽中Tα1含量（0.6%～1.0%）。

洗脫峰Ⅱ中Tα1的保留時(shí)間為3.093 min，峰面積為365 076，含量約為6.417 9 mg/mL。

洗脫峰Ⅲ中Tα1的保留時(shí)間為3.128 min，峰面積為207 480，含量約為3.649 0 mg/mL；由以上情況可以了解到，采用優(yōu)化的陰離子交換色譜對(duì)Tα1進(jìn)行分離純化，效果較好，出現(xiàn)三個(gè)洗脫峰，經(jīng)測(cè)定，洗脫峰Ⅰ中Tα1的含量達(dá)到24.596 6 mg/mL。

3 結(jié)論

采用QAE Sephadex A-25陰離子交換介質(zhì)，pH 7.0、20 mmol/LTris·HCl緩沖液作為離子交換色譜的結(jié)合緩沖液（A 液），20 mmol/LTris·HCl，0～50 mmol/LNaCl作為洗脫緩沖液（B液）進(jìn)行階躍式洗脫，流速60 cm/h，填料高度50cm，進(jìn)樣濃度8mg/mL對(duì)胸腺肽α1純化，可以達(dá)到純度為24.596 mg/mL的胸腺肽α1制品。

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Studies on the Isolation and Purification of Thymosin α1by Ion-exchange Chromatography

LIU Yan-yan1，2， LIU Ming-fei1， GAO Wei1， ZHANG Li-ping1，2
（1.Department of Food Science， HLJ Bayi Agriculture University， Daqing 163319， Heilongjiang， China；2.Biological and Agricultural Engineering College， Changchun 130022， Jinlin，China）

Abstract：Through purifying thymosin α1and improve the purity of thymosin α1 in order to research a simple and feasible purification technology.The study chooses QAE Sephadex A-25 and D208，D301，717 ect.for static IV adsorption experiment through the anion exchange chromatography in order to determine the optimumion exchange media； The optimal experiment conditions of the eluent， eluting style， flow rate，height of media are studied and chooseL9（33）orthogonal experiment on optimizing the conditions of the velocity， height and the concentration.The study choosesHPLC and SDS-PAGE to identifying the thymosin α1. The experiment showed that theQAE Sephadex A-25 as a fillermedia adsorbing thymosin α1makes the best effect， the velocity is 60 cm/h， packing height is 50 cm，the concentration is 8 mg/mL，then the purification results is satisfactory.Determined by the HPLC，the purity of thymosin α1is 24.596 6 mg/mL， the mass percent is 12.03%.The method is accurate and feasible.The purity of thymosinα1is 10 times higher than the commercial thymosin α1 products （themass percent is 0.6%to 1.0%）.

Key words：Thymosin α1； ion-exchange chromatography； isolation and purification

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.12.006

黑龍江省科技攻關(guān)項(xiàng)目（NOGB 06B0403-3）

劉妍妍（1979—），女（漢），講師，碩士，研究方向：畜產(chǎn)品加工。

2012-09-10