陳 徑 匡新宇 徐 虹 沈 茜 湯小山

近年來，成人疾病源于胎兒期的假說［1］獲得了越來越多的支持，宮內(nèi)環(huán)境與成年期疾病的相關(guān)性逐漸受到關(guān)注。研究顯示不良的宮內(nèi)環(huán)境不僅可引起宮內(nèi)發(fā)育遲緩( IUGR) ，而且可通過“發(fā)育程序化”途徑，對機(jī)體各器官結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生長期以至終身的影響，如高血壓、冠心病、2 型糖尿病和慢性腎臟病等［1］。生后長期隨訪證實(shí)，IUGR明顯增加了發(fā)生蛋白尿和終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)［2，3］，但其機(jī)制仍未闡明。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Wilms 瘤1( WT1) 基因可能是IUGR 引起生后腎小球數(shù)目減少等腎臟病變的重要分子［4］，并且已有研究發(fā)現(xiàn)WT1 基因的表達(dá)可能與DNA甲基化相關(guān)［5］。因此，本研究擬通過已建立的IUGR 大鼠模型，觀察宮內(nèi)環(huán)境對生后成年期大鼠腎臟功能的影響，并對WT1 基因甲基化水平進(jìn)行定量分析，探討其在“發(fā)育程序化”腎臟疾病中的作用。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級雌性SD 大鼠6 只，體重250 ～300 g。復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 IUGR 大鼠模型建立 雌性SD 大鼠與雄性大鼠交配受孕后，分為2 組，每組3 只。其中一組以孕期全程低蛋白飼料(6%低蛋白等熱卡飼料) 飼養(yǎng)［6］，自由采食，直至自然分娩，所生新生鼠出生體重在正常新生鼠平均體重2 s 以下者為IUGR 新生鼠［7］，作為IUGR 組。另一組以孕期常規(guī)飼料(22%蛋白) 飼養(yǎng)至自然分娩，新生鼠作為對照組。兩組均選取8 只新生雄鼠作為研究對象，母乳喂養(yǎng)3周，第4 周斷乳后以常規(guī)飼料喂養(yǎng)至12 周齡( 成年期) 。

1.3 標(biāo)本采集 12 周齡時(shí)，代謝籠收集兩組大鼠24 h 尿液用于尿蛋白定量檢測；10%水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈插管收集血標(biāo)本測定血生化指標(biāo)；腎臟在腹主動(dòng)脈插管后注入4℃預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)灌洗，摘取右側(cè)腎臟，分離皮質(zhì)并速凍于液氮中，-80℃保存，用于腎組織總RNA 抽提；同時(shí)摘取左側(cè)腎臟，用于腎小球數(shù)目測定。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 生化指標(biāo) 采用日立7060 型全自動(dòng)生化分析儀檢測血清總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮、尿酸和胱抑素-C 水平；比色法測定24 h 尿蛋白定量。

1.4.2 腎小球數(shù)目測定 左側(cè)腎臟置于10%中性福爾馬林溶液中，常規(guī)石蠟包埋。石蠟切片機(jī)平行于腎臟短軸經(jīng)腎門橫斷修塊，3 μm 切片，蘇木精-伊紅染色。由復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院病理科醫(yī)生單盲計(jì)數(shù)腎小球數(shù)目。

1.4.3 WT1 基因及甲基化轉(zhuǎn)移酶( DNMT) mRNA 的表達(dá)

抽提大鼠腎臟總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)PCR法檢測WT1、DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b mRNA 表達(dá)水平，以β-actin 作為內(nèi)參，引物見表1。目的基因與β-actin的Ct 值的差值為ΔCt 值，目的基因與參照樣品ΔCt 值的差值為ΔΔCt 值，以2 -ΔΔCt 為相對含量進(jìn)行分析。

表1 實(shí)時(shí)PCR 所用引物序列及基因擴(kuò)增長度Tab 1 Sequences of primer and the length of product with real-time PCR

1.4.4 WT1 基因啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化狀態(tài)測定 采用AxyPreP 基因組DNA 小量試劑盒抽提大鼠腎皮質(zhì)基因組DNA。使用EZ DNA Methylation-Gold-Kit( Zymo Research)進(jìn)行基因組DNA 轉(zhuǎn)化。WT1 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島采用Epityper 軟件設(shè)計(jì)PCR 引物( http: //epidesigner. com，表1) 。每對引物反義鏈添加T7-啟動(dòng)子，正義鏈添加10-mer調(diào)整熔點(diǎn)差異。以亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的DNA 為模板，應(yīng)用熱啟動(dòng)TaqDNA 酶擴(kuò)增目的基因片段。使用MassARRAY Nanodispenser RSl000 點(diǎn)樣儀將純化后PCR 產(chǎn)物點(diǎn)至SpectroCHIP 芯片上，運(yùn)用MassARRAY Workstation Compact進(jìn)行SpectroCHIP 檢測，檢測結(jié)果采用Epityper 軟件分析( Sequenom) 。

經(jīng)軟件分析，WT1 基因啟動(dòng)子區(qū)共有2 個(gè)CpG 島，120個(gè)CpG 位點(diǎn)，根據(jù)CpG 位點(diǎn)的密集程度共設(shè)計(jì)3 段PCR引物，擴(kuò)增片段信息如表2 所示。

表2 MassARRAY 定量甲基化分析引物序列、長度、位置及包含CpG 位點(diǎn)數(shù)量Tab 2 Primer sequences，product length，position，and CpG units by MassArray quantitative methylation analysis

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體重比較 IUGR 組新生雄鼠出生體重顯著低于對照組，(4.8 ±0.2) vs (7.4 ±0.1) g( P ＜0.000 1) ，并且直至12 周齡時(shí)體重仍低于對照組( P =0.043) ，未能達(dá)到生長追趕( 表3) 。

2.2 兩組大鼠腎功能比較 與對照組相比，12 周齡時(shí)IUGR 組大鼠24 h 尿蛋白定量顯著增高( P =0.016) ； 血清胱抑素C 水平也顯著升高( P =0.036) ，但血清總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮和尿酸水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 均＞0.05) ( 表3) 。

2.3 兩組大鼠腎小球數(shù)目比較 12 周齡時(shí)IUGR 組大鼠腎小球數(shù)目明顯少于對照組( P=0.001) ( 表3) 。

表3 兩組大鼠12 周齡時(shí)體重、生化指標(biāo)和腎小球數(shù)目比較( x±s)Tab 3 Comparison of body weight，biochemical parameters and the number of glomerular at 12 weeks of age between two groups( x±s)

2.4 兩組大鼠腎組織WT1 基因mRNA 的表達(dá) 12 周齡時(shí)IUGR 組大鼠腎組織WT1 基因mRNA 的表達(dá)顯著高于對照組，(3.55 ±0.53) vs (1.58 ±0.59) ，P=0.047。

2.5 兩組大鼠腎臟WT1 基因甲基化水平 12 周齡時(shí)，IUGR 組大鼠WT1 基因啟動(dòng)子區(qū)DNA 平均甲基化水平較對照組顯著降低，( 0.13 ±0. 01) vs ( 0. 18 ±0. 02) ，P =0.029，其中M1 和M3 段降低更為顯著，P 值分別為0.028和0.012。Pearson 相關(guān)性分析顯示，WT1 基因mRNA 水平和WT1 基因M1 段甲基化水平呈負(fù)相關(guān)，r = -0.939，P =0.000 1。

2.6 兩組大鼠腎臟甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá) 12 周齡時(shí)，IUGR 組大鼠DNMT1 和DNMT3b mRNA 表達(dá)水平較對照組顯著降低，DNMT1:(2.06 ±0.28) vs ( 3.89 ±0.36) ( P =0.003) ，DNMT3b:(0.94 ±0.13) vs ( 1. 53 ±0. 13) ( P =0. 010) ；DNMT3a mRNA 水平則與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(4.68 ±0.44) vs (5.10 ±0.51) ，P =0.749。Pearson 相關(guān)性分析顯示，DNMT1 和DNMT3b mRNA 水平與WT1 基因M1 段甲基化水平呈正相關(guān)，DNMT1: r = 0. 935，P =0.000 1；DNMT3b:r=0.895，P=0.000 1。

3 討論

本研究以孕期低蛋白飲食建立IUGR 大鼠模型，結(jié)果顯示，成年期時(shí)IUGR 組大鼠尿蛋白排泄明顯增多，且腎臟WT1 基因mRNA 表達(dá)顯著增高； 研究還顯示IUGR 組大鼠腎臟WT1 基因DNA 甲基化水平顯著降低，且與DNMT1、DNMT3b mRNA 的表達(dá)減低相關(guān)，提示DNMT1 和DNMT3b調(diào)節(jié)的WT1 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的降低，可能參與了WT1 基因過表達(dá)的發(fā)生，可能是IUGR 大鼠成年期發(fā)生蛋白尿的重要機(jī)制之一。

IUGR 組大鼠出生體重顯著低于對照組，且腎小球數(shù)目顯著減少，與本課題組前期研究結(jié)果一致［8］。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示IUGR 組大鼠血清胱抑素C 水平顯著增高。胱抑素C 作為腎功能早期受損的敏感指標(biāo)，提示IUGR 組大鼠腎臟濾過功能受損。Brenner 等［9］提出先天性腎單位數(shù)目減少是引起腎臟損害的重要機(jī)制之一。IUGR 大鼠由于先天腎小球數(shù)目減少，使得剩余腎小球處于高灌注和高濾過狀態(tài)，以代償和維持腎功能的穩(wěn)定。這種長期的代償過程，可能加重腎臟負(fù)擔(dān)，并將最終影響腎臟功能。

WT1 基因在發(fā)育成熟的腎臟中僅在足細(xì)胞中表達(dá)，以維持足細(xì)胞的正常功能［10］。作為轉(zhuǎn)錄因子，WT1 基因還可與NPHS1 和PODXL 啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，使足細(xì)胞重要分子Nephrin 和podocalyxin 的表達(dá)失衡［11，12］，從而影響足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。腎小球足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過膜的關(guān)鍵組分，對維護(hù)腎小球的濾過屏障至關(guān)重要。而本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，成年期IUGR 大鼠存在足細(xì)胞足突的部分融合［8］。因此，推測WT1 基因mRNA 的過表達(dá)可能引發(fā)了足細(xì)胞的損傷，參與了IUGR 所致蛋白尿的發(fā)生。

在本研究模型中，孕期母體蛋白攝入的限制是唯一干預(yù)手段。有證據(jù)顯示，不良宮內(nèi)環(huán)境，如孕母飲食［13］、行為［14］及子宮動(dòng)脈血流［15］，都可引起表觀遺傳學(xué)變化，從而調(diào)控基因的表達(dá)。DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要方式之一，主要發(fā)生在CpG 二核苷酸的胞嘧啶上，可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的終止［16］。本研究通過MassARRAY 甲基化定量分析方法發(fā)現(xiàn)IUGR 組大鼠成年期腎臟WT1 基因甲基化水平顯著降低，并且其M1 段甲基化水平與WT1 基因mRNA 的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，提示W(wǎng)T1 基因甲基化水平的改變可能參與了其表達(dá)變化的調(diào)控。

DNA 甲基化是通過甲基轉(zhuǎn)移酶家族介導(dǎo)的，包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b 和DNMT3L，其中只有DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 具有甲基轉(zhuǎn)移活性。DNMT1主要在DNA 復(fù)制和修復(fù)中維持其甲基化水平，是細(xì)胞中表達(dá)最多的甲基轉(zhuǎn)移酶［17］；而DNMT3a 和DNMT3b 則是在胚胎發(fā)育階段建立甲基化狀態(tài)，即甲基化的從頭合成，因此DNMT3a 和DNMT3b 在胚胎干細(xì)胞呈高表達(dá)水平，相反，在已分化成熟的細(xì)胞中則呈現(xiàn)低水平表達(dá)［18］。本研究中，12周齡時(shí)IUGR 大鼠腎臟DNMT1 和DNMT3b mRNA 的表達(dá)顯著降低，并與WT1 基因甲基化水平呈正相關(guān)，提示DNMT1 和DNMT3b 調(diào)節(jié)的WT1 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的降低可能是WT1 基因過表達(dá)的重要機(jī)制之一。

總之，研究結(jié)果顯示IUGR 大鼠腎臟存在WT1 基因甲基化模式的異常改變，并且可能參與了WT1 基因的異常表達(dá)，這些改變可能是IUGR 大鼠成年期出現(xiàn)蛋白尿的分子機(jī)制之一。這一結(jié)果為進(jìn)一步完善“發(fā)育程序化”腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制提供了更為廣闊的思路。

本研究的不足之處:僅對IUGR 大鼠腎臟WT1 基因的表達(dá)、WT1 基因甲基化水平進(jìn)行了檢測，而WT1 基因甲基化的異常改變是否參與了WT1 基因表達(dá)的調(diào)控，并且通過何種途徑導(dǎo)致了蛋白尿的發(fā)生仍有待進(jìn)一步研究。

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