孫敏華，董嘉文，李林林，袁建豐，胡奇林

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所廣東省公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室禽病研究室，廣東廣州510640)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的，一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的急性高度接觸性傳染病[1]。NDV為副粘病毒科副粘病毒亞科禽腮腺炎病毒屬成員[2]。其基因組為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA，長(zhǎng)約15.2kb[1]，至少編碼6種蛋白，分別為NP、P、M、F、HN和L蛋白。F蛋白(融合蛋白)和HN蛋白(血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白)是病毒的主要免疫原性蛋白，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。F蛋白介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的膜融合，其裂解位點(diǎn)序列與病毒毒力有關(guān)[1,3]，HN蛋白具有吸附、神經(jīng)氨酸酶及促進(jìn)融合等作用，此外還可能與病毒毒力有關(guān)[4]。

盡管NDV只有一個(gè)血清型，但其包含兩個(gè)Class，其中Class I包含9個(gè)基因型，而Class II包含的基因型多達(dá)10個(gè)。目前我國(guó)主要流行Class II中的基因Ⅶ型，其中以Ⅶd亞型多見(jiàn)，盡管基因Ⅶa、Ⅶc、Ⅶd、Ⅶe、Ⅶf亞型均見(jiàn)報(bào)道[5]，但基因Ⅶb亞型分離株尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究從佛山三水發(fā)病鵝病料中分離鑒定出一株NDV，經(jīng)序列分析表明其為基因Ⅶb亞型。因此，本研究主要對(duì)該病毒株的F和HN蛋白進(jìn)行分析，了解其主要免疫原性蛋白的變化情況，為ND的防制提供參考。

1 材料和方法

1.1 SPF雞胚 9日齡～11日齡SPF雞胚由廣東永順生物制藥有限公司提供。

1.2 主要試劑 NDV標(biāo)準(zhǔn)抗原及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；引物由Invitrogen公司合成；Ex Taq DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、pMD18-T載體、膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；TRIzol試劑、M-MuLV購(gòu)自Invitrogen公司；DH5α感受態(tài)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 病毒的分離鑒定 采集2010年佛山市三水區(qū)某養(yǎng)鵝場(chǎng)疑似ND發(fā)病鵝的心臟、肝臟、脾臟、腎臟等組織，并進(jìn)行病毒分離[6]，收獲死亡雞胚尿囊液，按ND診斷技術(shù)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行HA和HI試驗(yàn)[7]。

1.4 引物的設(shè)計(jì)及F和HN基因的擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)并合成引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆，陽(yáng)性菌液由Invitrogen公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 F和HN基因核苷酸進(jìn)化樹(shù)繪制及序列分析從GenBank下載44株NDV F基因ORF的前374nt序列及21株NDV HN基因的ORF序列，利用DNAStar 6.0軟件包將它們與本次分離株的F和HN基因一起進(jìn)行序列分析。使用MegAlign中的Clustal V方法，在F基因核苷酸水平上繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒的鑒定及分子特征 病料接種SPF雞胚后，所有雞胚72h內(nèi)死亡。HA和HI試驗(yàn)結(jié)果顯示，所收獲的尿囊液具有血凝活性，并且能夠被NDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清完全抑制。經(jīng)F和HN基因擴(kuò)增、序列測(cè)定和分析表明，該分離株F蛋白裂解位點(diǎn)序列為112RRQKRF117，符合強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)特征；HN蛋白由571個(gè)氨基酸殘基組成，也符合強(qiáng)毒株的分子特征。從F和HN蛋白序列的分子特征綜合判斷，Goose/Foshan/2010株為強(qiáng)毒株。

2.2 F和HN基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及序列相似性分析參考文獻(xiàn)[5]和[6]，利用Mega 4.0軟件繪制F基因ORF前374nt序列的進(jìn)化樹(shù)，并將44株NDV劃分為9個(gè)基因型(圖1)。進(jìn)化分析顯示，本次所分離的病毒株屬于基因Ⅶb亞型。經(jīng)核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列相似性比較后顯示，Goose/Foshan/2010株與基因Ⅰ型(Queensland V4)、Ⅱ型(B1、La Sota)、Ⅲ型(Mukteswar)疫苗株之間F基因核苷酸的相似性分別為82.6%、79.9%和81.6%，氨基酸的相似性分別為83.1%、77.4%和79.8%。這表明，與疫苗株相比，基因Ⅶb亞型病毒株已經(jīng)存在一定變異。Goose/Foshan/2010株與基因Ⅶb亞型病毒株間核苷酸及氨基酸相似性均高于90.4%，其中與秘魯分離株APECK92173(AV 1474/922)，馬來(lái)西亞分離株BMYBU87078(AV 1094/90144)、MB076/05之間核苷酸和氨基酸序列相似性最高，分別為93.3%～95.5%和93.5%～97.6%，表明Goose/Foshan/2010株可能與它們具有共同來(lái)源。盡管周邊國(guó)家(如哈薩克斯坦、日本)曾發(fā)現(xiàn)過(guò)基因Ⅶb亞型病毒株，但這些病毒株與歐洲流行株關(guān)系密切，而Goose/Foshan/2010株與秘魯及東南亞基因Ⅶb亞型病毒株關(guān)系密切。流行情況及進(jìn)化關(guān)系表明，我國(guó)首次分離的基因Ⅶb亞型病毒株Goose/Foshan/2010株極可能來(lái)自東南亞。相對(duì)而言，Goose/Foshan/2010株與基因Ⅶa、Ⅶc、Ⅶd、Ⅶe亞型病毒株核苷酸及氨基酸相似性略低，分別為88.0%～92.8%、89.5%～96.0%；它與我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E9株間核苷酸及氨基酸相似性分別為84.8%、92.2%。由此，同一基因型中的分離株序列相似性較高，而進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)的分離株間則較低。盡管此前有報(bào)道表明個(gè)別NDV分離株出現(xiàn)了重組現(xiàn)象[8]，并推薦利用F和HN基因序列同時(shí)分析。本研究用Goose/Foshan/2010株F和HN基因及其推導(dǎo)氨基酸序列繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)極其相似，并且它們與F基因ORF前374nt所繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并無(wú)明顯差異。

2.3 F蛋白和HN蛋白的變異 F和HN蛋白是病毒的兩個(gè)主要免疫原性蛋白。Goose/Foshan/2010株F蛋白上的6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)、12個(gè)半胱氨酸殘基、7個(gè)中和位點(diǎn)均高度保守，表明其F蛋白并未發(fā)生大的變異。HN蛋白中也有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，Goose/Foshan/2010株缺失了538位～540位的潛在糖基化位點(diǎn)。盡管該位點(diǎn)不被糖基化，但分析表明，基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅸ型病毒株多存在此位點(diǎn)，而基因Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅶ型則多缺失該位點(diǎn)。此外，HN蛋白發(fā)生E347D和K495E兩個(gè)點(diǎn)突變。經(jīng)分析表明，基因Ⅶ型病毒株第347位抗原位點(diǎn)變異無(wú)明顯規(guī)律，而第495位抗原位點(diǎn)除基因Ⅰ型、Ⅲ型、和Ⅸ型為K，基因Ⅳ型為G，基因Ⅱ型弱病毒株為V外，其余基因型病毒株多為E。HN蛋白第347和495位抗原位點(diǎn)極其重要，可能是不同病毒株抗原性差異的原因之一[9]。這表明Goose/Foshan/2010株的HN蛋白可能與疫苗株的抗原性存在一定差異。

目前，基因Ⅶ型病毒株在我國(guó)廣泛流行，并以基因Ⅶd亞型為主，基因Ⅶb亞型病毒株尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究從廣東地區(qū)首次分離鑒定出一株鵝源基因Ⅶb亞型NDV，豐富了病毒的流行病學(xué)資料。由于雞、鴨、鵝、鴿甚至野鳥(niǎo)群中廣泛存在基因Ⅶ型病毒株，新基因型的出現(xiàn)使得我國(guó)ND的流行情況更加復(fù)雜。因此，對(duì)ND的不斷監(jiān)測(cè)，做好綜合防控措施將有利于防制該病。

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[6]孫敏華，呂殿紅，董嘉文，等.一株鴿源新城疫病毒主要毒力基因分析[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2010，35(5)：30-34.

[7]劉華雷，吳艷濤，王志亮，等.中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).新城疫診斷技術(shù)[S].GB/T 16550-2008.

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