紀(jì)曉琳，王 琦，高玉龍，王永強(qiáng)，秦立廷，祁小樂，高宏雷，王笑梅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001)

J亞群禽白血病病毒(Avian leukosis virus sabgroup J)ALV-J屬于反轉(zhuǎn)錄病毒中的Al-pharetrovirus家族，其前病毒基因組結(jié)構(gòu)為5'-LTR-leadergag/pol-env-rTM-DR1-E-LTR-3'。1988年從英國肉雞中分離到第一株ALV-J原型病毒HPRS-103，其宿主范圍、病毒囊膜干擾和交叉中和試驗與A、B、C、D、E亞群不同，而獨(dú)立成為一個亞群[1-2]。HPRS-103主要引起肉雞產(chǎn)生以骨髓瘤為主的各種類型腫瘤[1-2]。1997年 Flady報道了美國也出現(xiàn)了ALV-J感染肉雞群的現(xiàn)象[3]。1999年，ALV-J首次在中國肉雞群中被分離到[4]，隨著其在中國雞群中的傳播，宿主范圍逐漸擴(kuò)大，能夠感染肉雞和蛋雞，并在蛋雞群中大規(guī)模流行[5]。ALV-J能夠?qū)е履承┑半u群中60%的雞發(fā)生腫瘤，并導(dǎo)致超過20%的被感染雞死亡，或者導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降，臨床上引起包括血管瘤、髓細(xì)胞瘤、組織肉瘤、成紅細(xì)胞瘤等多種類型的腫瘤，給養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。

反轉(zhuǎn)錄病毒的RNA聚合酶缺乏校對機(jī)制，其基因組有一個插入宿主基因組的過程，從而造成ALV-J在遺傳上的多變性。在分離ALV-J過程中，同時可以分離出ALV其他亞群，給研究其致病機(jī)理造成困難。本研究構(gòu)建了單一來源的ALV-J的感染性克隆rHLJ09SH01，并進(jìn)行蛋雞和肉雞的致病性試驗，為研究ALV-J對蛋雞和肉雞致病力差異奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細(xì)胞、載體和實驗動物 ALV-J HLJ09SH01分離株為本實驗室分離鑒定；DF-1細(xì)胞、pBluescript IIKS(+)載體和DH5a菌種為本實驗室保存；11日齡SPF來航蛋雞和商品系肉雞由哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 各種限制性內(nèi)切酶、PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、DNA Marker、dNTP 等 購 自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、核酸凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；Plasmid M idiKits購自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄酶活性檢測試劑盒購自Roche公司；兔抗雞FITC-IgG購自Sigma公司。

1.3 引物設(shè)計 以GenBank中登錄的ALV-J原型株(Z46390)為參考，設(shè)計合成用于擴(kuò)增前病毒基因組的引物(表1)。

表1 擴(kuò)增pBlue-ALV-J前病毒基因組(pre-DNA)所用引物Table1Primers used for ALV-J pre-DNA amplification

1.4 HLJ09SH01株前病毒cDNA克隆的構(gòu)建 根據(jù)已完成的ALV-JHLJ09SH01株前病毒基因組的序列(HQ634806)，經(jīng)MapDraw軟件對拼接的序列進(jìn)行分析，采用PCR方法分3段擴(kuò)增SD1009株的前病毒cDNA(圖1)，PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆酶切后順次連接，獲得1個含有完整ALV-J前病毒cDNA的重組質(zhì)粒，命名為pBlue-HLJ09SH01。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及病毒拯救 采用QIAGEN Plasm id M idi Kits制備純化 pBlue-HLJ09SH01，由 LipofectctamineTM2000分別介導(dǎo)轉(zhuǎn)染約80%的單層DF1細(xì)胞，同時以正常的DF1細(xì)胞為對照，轉(zhuǎn)染后72h收獲病毒，反復(fù)凍融3次后連續(xù)在DF1中傳代。

1.6 病毒粒子的鑒定

1.6.1間接免疫熒光(IFA)檢測將第7代拯救病毒按常規(guī)方法接種于約60%單層的DF1細(xì)胞96孔板中，7d后按常規(guī)方法進(jìn)行IFA檢測，一抗為抗ALV-J的多克隆抗體，二抗為兔抗雞FITC-IgG。同時設(shè)不接種病毒細(xì)胞對照。

1.6.2ALV抗原檢測按照IDEXX Avian Leukosis Virus Antigen Test(ALV-Ag)試劑盒操作方法檢測病毒的P27抗原。

1.6.3反轉(zhuǎn)錄酶活性檢驗采用Roche的Reverse transcriptase assay試劑盒按照試劑盒說明書對拯救病毒的第7代進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶活性的檢測。

1.7 致病性試驗 將0.25m L的rHLJ09SH01(102.5/m L TCID50)經(jīng)雞胚靜脈接種11日齡SPF蛋雞雞胚和肉雞雞胚，待孵育出殼后，分別飼養(yǎng)32周。在飼養(yǎng)過程中，對病死雞進(jìn)行解剖，各臟器樣品進(jìn)行HE染色，確定腫瘤類型。32周后統(tǒng)一迫殺并對腫瘤進(jìn)行觀察。

2 結(jié) 果

2.1 ALV感染性克隆的構(gòu)建 以細(xì)胞培養(yǎng)ALV HLJ09SH01分離株的DNA為模板，分別采用3對特異性引物，對ALV前病毒DNA分3段進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)；并以該前病毒cDNA為模板，F(xiàn)3、R3為引物，PCR擴(kuò)增。以ClaⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物及pBluescript IIKS(+)，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化后，挑取白色菌落進(jìn)行鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pbw-c。以分離株HLJ09SH01的前cDNA為模板，F(xiàn)1、R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物與pbw-c以EagⅠ和XBaⅠ雙酶切，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化后，挑取單一菌落鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pbw-c-a。再以分離株HLJ09SH01的前cDNA為模板，F(xiàn)2、R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物與pbw-c-a分別以XbaⅠ和ClaⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化后，挑取單一菌落鑒定，將陽性重組質(zhì)粒命名為pbw-c-a-b。以ClaⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定pbw-c，以EagⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定pbw-c-a，以EagⅠ單酶切鑒定pBlue-HLJ09SH01，均獲得與預(yù)期一致的片段，表明構(gòu)建了pBlue-HLJ09SH01。

2.2 拯救病毒rHLJ09SH01的鑒定

2.2.1IFA鑒定rHLJ09SH01與抗ALV-J多克隆抗體呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，感染組DF-1細(xì)胞表面以及胞漿有明顯綠色熒光，對照組細(xì)胞沒有綠色熒光(圖3)，表明拯救了病毒。

2.2.2試劑盒檢驗以IDEXX Avian Leukosis Virus Antigen Test(ALV-Ag)檢測第7代拯救病毒，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過ELISA檢測，取多次檢測的平均數(shù)為1.306，陽性孔在OD650nm吸光度平均值為0.368，表明拯救了病毒。

2.2.3反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒檢驗拯救病毒采用Roche的Reverse transcriptase assay試劑盒，通過HIV繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過吸光度確定第7代拯救病毒的反轉(zhuǎn)錄酶活性，通過ELISA檢測，取多次檢測的平均數(shù)，ELISA在OD450nm處吸光度值為3.128，所對應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄酶活性為1.5281，HIV標(biāo)準(zhǔn)品反轉(zhuǎn)錄酶活性分別為0.0625、0.125、0.25、0.5和1，并以其繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表明拯救病毒具有反轉(zhuǎn)錄酶活性。

2.3 rHLJ09SH01在DF-1培養(yǎng)液的滴度 將第7代病毒液接種單層DF-1(106個)細(xì)胞，于感染后1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d分別取細(xì)胞上清，通過檢測反轉(zhuǎn)錄酶活性，反映rHLJ09SH01在體外的生長復(fù)制水平(圖4)。

2.4 rHLJ09SH01的致病性 感染rHLJ09SH01的蛋雞中存在57.9%的雞發(fā)生腫瘤(11/19)，被感染肉雞中有83.3%雞發(fā)生腫瘤(10/12)，對照組沒有雞出現(xiàn)腫瘤。肉雞和蛋雞發(fā)生腫瘤的位置均在肝臟、腎臟、肺臟和小腸等器官。剖檢可見明顯的腫瘤，病理切片可以觀察有大量瘤細(xì)胞浸潤正常細(xì)胞(圖5)。

3 討論

針對目前分離的ALV-J存在與其他病毒或ALV其他亞群交叉感染的情況，很難純化得到單一的病毒。構(gòu)建單一來源ALV-J的感染性克隆是獲得病毒純化培養(yǎng)的有效方法。由于反轉(zhuǎn)錄病毒的感染性克隆不需要人工插入啟動子，為了排除質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染蛋白的可能性，本研究將轉(zhuǎn)染后的病毒接種DF1細(xì)胞，并維持7d，依次傳代，每一代次均在DF1中維持7d，再進(jìn)行病毒活性檢測，最終確定獲得拯救病毒。

本研究在蛋雞分離ALV-J的基礎(chǔ)上構(gòu)建了感染性克隆，并拯救出病毒。為進(jìn)一步探究拯救病毒是否具有天然病毒的致病性，進(jìn)行了rHLJ09SH01感染性蛋雞和肉雞的致病性試驗。結(jié)果表明，rHLJ09SH01可以導(dǎo)致蛋雞和肉雞發(fā)病，分別引起57.9%的蛋雞和83.3%的肉雞發(fā)生腫瘤。雖然rHLJ09SH01是蛋雞來源的ALV-J，但仍可以導(dǎo)致肉雞發(fā)病，并且肉雞發(fā)生腫瘤的比率高于SPF蛋雞，可能是因為本研究持續(xù)進(jìn)行了238d，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正常商品代肉雞的飼養(yǎng)周期，腫瘤的發(fā)生本身是一個多因素的過程，所以rHLJ09SH01致商品代肉雞的出瘤率高于SPF蛋雞。

目前鮮有關(guān)于ALV-J致肉雞發(fā)病的報道，本研究結(jié)果表明，國內(nèi)流行的ALV-J也可以導(dǎo)致肉雞發(fā)病。在本研究中，rHLJ09SH01導(dǎo)致肉雞發(fā)病的情況發(fā)生在人工感染后70d，ALV-J導(dǎo)致商品代肉雞發(fā)病的時間超過其正常飼養(yǎng)周期，雖然父母代肉雞飼養(yǎng)周期較長，但其飼養(yǎng)數(shù)量較少，凈化及預(yù)防措施相對完善，這可能是目前鮮有ALV-J感染肉雞的報道的原因。

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