李恩擴(kuò)，陳雪鋒，孔 斌，胡敬東

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018)

白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)，主要是由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，其分泌水平的高低可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)[1-2]。

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)是一種可以造成感染雞只嚴(yán)重免疫抑制后果的腫瘤病毒[3]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)REV感染雞免疫器官中IL-2mRNA的表達(dá)水平，可以對(duì)免疫器官中T細(xì)胞的活化程度進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，以研究IL-2在REV致病中的作用。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 REV由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院孫淑紅提供；1日齡SPF雞購(gòu)自山東濟(jì)南SAIS家禽科技有限公司(許可證號(hào) SCXK[魯]20090003)。

1.2 主要試劑 SYBR Green熒光定量PCR試劑盒和DNA Marker DL2000購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；TransZol Up和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物合成 根據(jù)GenBank中登錄的雞IL-2(ChIL-2)基因(AJ224516.1)和內(nèi)參核糖體蛋白亞基4(RPL4)基因序列(AJ720803.1)，應(yīng)用 DNAStar軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。ChIL-2引物為，P1：5'-TCTTTGG CTGTATTTCGG-3'， P2： 5'-CTGGGTCTCAGTTGGT GT-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段為270bp；RPL4引物為，P3：5'-TCTGCATTTGGACTGAAAGC-3'， P4： 5'-TTCTG GATCTCCTGGCTTCT-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段為154bp。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成 雞的3種免疫器官細(xì)胞總RNA提取按照TransZol Up說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄按照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperM ix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，cDNA合成反應(yīng)體系為20μL：總 RNA 1μg，0.5μg/μL Oligo(dT)181μL，10μL 2×TS Reaction M ix，1μL TransScript RT/RI Enzyme M ix，其余加RNase-free水補(bǔ)足，混勻后于42℃孵育30m in，85℃反應(yīng)5min，cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 IL-2和RPL4基因片段的擴(kuò)增與鑒定 采用20μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各取上步反應(yīng)得到的cDNA 6μL，分別加入 10μmol/L P1和 P2、P3和P4引物 2μL，25mmol/L dNTP 2μL，10μL 2×PCR ReactionM ix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃5m in；94℃ 30s、58.5℃ 45s(ChIL-2)/60℃ 30s(RPL4)、72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)； 72℃10m in。擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。經(jīng)膠回收，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落后擴(kuò)大培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR初步鑒定正確后，陽(yáng)性重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，按文獻(xiàn)[4]方法計(jì)算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD-chIL-2和pMDRPL4作為本研究的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6 IL-2SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立 反應(yīng)總體積為20μL，其中SYBR Premix Ex TaqTM(200×)10.0μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4μL，上、下游引物(10μmol/L)各 0.3μL，質(zhì)粒模板2.0μL，滅菌蒸餾水7.0μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃15s；95℃ 5s，60℃ 34s，40個(gè)循環(huán)。為了分析SYBR Green IPCR擴(kuò)增特異性，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物制作熔解曲線，條件為：95℃15s，60℃1m in，95℃15s，60℃15s。反應(yīng)設(shè)內(nèi)參RPL4基因和空白對(duì)照。并利用相應(yīng)軟件進(jìn)行分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線[5]。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn) 120只1日齡SPF雞隨機(jī)分為兩組：REV處理組和正常對(duì)照組(處理組每只腹腔注射102TCID50REV，對(duì)照組注射生理鹽水)，每組60只，相同方式飼養(yǎng)，每組分別于7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d隨機(jī)取6只迫殺，立即取脾臟、胸腺和法氏囊并置于-80℃，備用。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同時(shí)期IL-2基因m RNA的轉(zhuǎn)錄水平 以純化的cDNA為模板，內(nèi)參RPL4為對(duì)照，每一時(shí)期取6個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)兩次，用建立的最優(yōu)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析 根據(jù)比較閾值法[4]計(jì)算出目的基因的相對(duì)含量，目的基因的相對(duì)含量=2-△△Ct。注釋：△△Ct=[CtT-CtHK]X-[CtT-CtHK]0，T=待測(cè)基因；HK=內(nèi)參基因；X=待測(cè)樣本；0=校正樣本。數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組試驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 IL-2和內(nèi)參RPL4基因片段的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定 以雞免疫器官細(xì)胞提取的總RNA為模板，通過(guò)特異性引物擴(kuò)增chIL-2和RPL4基因片段，經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，其擴(kuò)增片段分別約為270bp和154bp(圖1)，與預(yù)期大小相符。對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD-chIL-2和pMD-RPL4進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果兩基因片段均與GenBank中登錄的序列完全一致。

2.2 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線分析表明，該方法擴(kuò)增的目的基因(IL-2)和內(nèi)參基因(RPL4)均具有特異性，只出現(xiàn)各自的單一峰(圖2)，無(wú)引物二聚體或其他非特異性產(chǎn)物生成。

該方法具有較高的靈敏度，IL-2的檢測(cè)下限為100copies/μL，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率分別為-3.0406(IL-2)和-3.1504(RPL4)，兩基因的擴(kuò)增效率均在107%左右，其相關(guān)系數(shù)也均在0.99以上(圖3、圖4)，符合比較閾值法相對(duì)定量分析的前提，檢測(cè)所得Ct值可以按比較閾值法分析[4]。

2.3 IL-2基因熒光定量的表達(dá)水平 本實(shí)驗(yàn)將對(duì)照組7d時(shí)IL-2基因的表達(dá)量作為參照因子，處理組及其他時(shí)期IL-2基因的表達(dá)量與其相比，得到相應(yīng)基因表達(dá)量的倍數(shù)，采用內(nèi)參RPL4對(duì)IL-2基因進(jìn)行均一化處理，SPF雞免疫器官IL-2基因的相對(duì)表達(dá)情況見(jiàn)圖5～圖7。

圖5～圖7表明，處理組與對(duì)照組相比，除21d、28d脾臟IL-2基因表達(dá)量升高但不顯著以外(p>0.05)，其他均表現(xiàn)顯著升高(p<0.05)。

3 討 論

IL-2主要由激活的Th1淋巴細(xì)胞產(chǎn)生并分泌，它通過(guò)與IL-2受體(IL-2R)結(jié)合產(chǎn)生以下作用：(1)刺激T淋巴細(xì)胞增殖；(2)激活T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生殺滅腫瘤細(xì)胞作用；(3)刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)等免疫增強(qiáng)因子，間接增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生殺滅腫瘤細(xì)胞作用[6]；(4)通過(guò)刺激產(chǎn)生TNF使腫瘤細(xì)胞凋亡，在機(jī)體免疫中處于中心地位。許多實(shí)驗(yàn)證明，ChIL-2與哺乳動(dòng)物的IL-2生物活性相似，作為一種免疫調(diào)節(jié)分子在雞的免疫系統(tǒng)中起重要作用[7]。利用IL-2活性檢測(cè)來(lái)反映淋巴細(xì)胞功能，特別是T細(xì)胞的功能，日趨用于免疫功能的研究[8]。

Xu等研究表明，m iR-26a作為一種腫瘤抑制物，在REV轉(zhuǎn)化形成的多種淋巴瘤細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)，可以引起其靶基因ChIL-2的過(guò)表達(dá)，繼而刺激瘤細(xì)胞的增殖[9]。這一發(fā)現(xiàn)支持了我們的結(jié)果，即REV感染可以導(dǎo)致IL-2基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。IL-2能夠刺激產(chǎn)生TNF[6]，而且已有學(xué)者報(bào)道，REV感染會(huì)引起脾細(xì)胞腫瘤壞死因子(TNF)水平明顯增高，這種過(guò)高水平的TNF對(duì)免疫器官具有免疫損傷作用，與免疫功能的下降密切相關(guān)[10]。但Hrdlickova等研究認(rèn)為，REV-T株感染轉(zhuǎn)化的瘤變細(xì)胞膜上IL-2R結(jié)合性地降低IL-2的水平，使IL-2大大減少，造成嚴(yán)重的免疫功能障礙[11]。國(guó)內(nèi)李廣興等的研究結(jié)果顯示SPF雛雞感染REV后造成胸腺和脾臟T淋巴細(xì)胞IL-2誘生活性明顯降低[12]。

脾臟、法氏囊和胸腺是禽類的主要免疫器官，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)REV感染雞上述器官的IL-2表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，除了試驗(yàn)組21日齡、28日齡雞的脾臟IL-2基因轉(zhuǎn)錄水平升高但不明顯外(p>0.05)，其他處理組與正常對(duì)照組相比均存在顯著差異(p<0.05)。

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