劉啟生，王振寶，王 真，哈 森，張玉婷，巴音查汗*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆伊犁835000)

牛巴貝斯蟲(Babesia bovis)是一種蜱媒血液原蟲，牛屬動(dòng)物感染后，出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、血紅蛋白尿、共濟(jì)失調(diào)等癥狀，嚴(yán)重時(shí)引起死亡，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。B.bovis與雙芽巴貝斯蟲(B.bigem ina)、牛環(huán)形泰勒蟲(Theileria annulata)等梨形蟲(牛焦蟲)常常混合感染牛只，嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展[2-3]，梨形蟲的混合感染和隱性感染對(duì)牛血液原蟲病的防治帶來(lái)了一定困難。

目前，國(guó)外學(xué)者對(duì)B.bovis進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)的報(bào)道較多，常規(guī)PCR、套式PCR和基于SYBR Green染料的實(shí)時(shí)熒光PCR在B.bovis的檢測(cè)方面均有應(yīng)用[4-6]。常規(guī)PCR存在靈敏度低，檢測(cè)周期較長(zhǎng)等缺點(diǎn)；套式PCR靈敏度高，但兩步的PCR反應(yīng)繁瑣、易污染，不適用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查；實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快，與常規(guī)PCR相比不存在交叉污染和核酸染料對(duì)人體的危害等缺點(diǎn)，近年來(lái)逐漸應(yīng)用于各種病原體的定性檢測(cè)[7-10]。本研究建立檢測(cè)B.bovis的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，為B.bovis的早期、快速檢測(cè)，梨形蟲病的防控及分子流行病學(xué)研究提供了一種新的檢測(cè)手段。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)蟲株 B.bovis、B.bigemina蟲株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供；T.annulata蟲株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 主要試劑 全血DNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、DL2000Marker、膠回收試劑盒、pMD19-T載體、質(zhì)粒提取試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物與探針 通過(guò)比對(duì)GenBank中B.bovis 18S rRNA基因的保守序列，使用PrimerPrim ier5和Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一條探針：BboF：5'-GTGTTTCAAGCAGGTTTCGC-3'； BboR： 5'-CGT GCGTCATCGACAAATCT-3'； BboP： 5'-FAM-TGAG CATGGAATAACCTTGTATGACCCT-TAMRA-3'，目的片段大小為160bp。引物和探針均由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 蟲體DNA提取及標(biāo)準(zhǔn)品制備 采用全血DNA提取試劑盒提取B.bovis DNA，應(yīng)用特異性引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的片段連接至pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒并由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將鑒定正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板并測(cè)定濃度。

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化以標(biāo)準(zhǔn)品為模板，對(duì)Mg2+、dNTPs、引物、探針退火延伸溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和敏感性試驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)微量核酸蛋白分析儀測(cè)定濃度，用TE緩沖液稀釋成10倍系列梯度濃度(1.31×108copies/μL～1.31×100copies/μL)作為模板，于-20℃保存。按優(yōu)化好的體系條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)以上述梯度濃度模板進(jìn)行常規(guī)PCR試驗(yàn)，比較兩者的靈敏度。

1.7 特異性試驗(yàn) 提取B.bovis、B.bigem ina、T.annulata和健康牛血的DNA作為模板，用雙蒸水做為空白對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，評(píng)價(jià)試驗(yàn)的特異性。

1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取4個(gè)不同濃度的樣品作為模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，重復(fù)3次。收集數(shù)據(jù)，計(jì)算組內(nèi)、組間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)試驗(yàn)的穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品的檢測(cè) 從分別采自吐魯番、伊犁的23份疑似病例血液樣品提取DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，評(píng)價(jià)實(shí)時(shí)熒光PCR的臨床應(yīng)用性。

2 結(jié) 果

2.1 陽(yáng)性模板的鑒定 以B.bovis DNA為模板經(jīng)常規(guī)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增的目的片段與預(yù)期(160bp)一致(圖1)，陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序比對(duì)，與GenBank中登錄的B.bovis18S rRNA基因序列的同源性達(dá)到98%～100%。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件的確定 經(jīng)優(yōu)化建立如下反應(yīng)體系：10×PCR buffer(Mg2+free)2.5μL，MgCl2(25mmol)3.5μL，dNTPs(10mmol)0.5μL，BboF/BboR(10μmol)各 1μL，Taq Man探針(10μmol)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5u/μL)0.5μL，模板DNA 1μL，加滅菌雙蒸水至25μL。反應(yīng)條件為：95℃ 2m in；95℃ 10s、55℃ 60s，45個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度 以10倍系列梯度濃度(1.31×108copies/μL～1.31×100copies/μL)的陽(yáng)性重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，濃度為1.31×101copies/μL時(shí)依然有擴(kuò)增曲線(圖 2)。模板濃度與CT值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，回歸方程為：CT=-3.346lg(X)+43.50。擴(kuò)增效率為99%，符合實(shí)時(shí)熒光PCR的試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果。常規(guī)PCR的檢測(cè)濃度下限為1.31×104copies/μL(圖3)，靈敏度遠(yuǎn)低于實(shí)時(shí)熒光PCR。

2.4 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行特異性試驗(yàn)顯示，B.bovis出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線，B.bigemina、T.annulata、健康牛血和空白對(duì)照均未產(chǎn)生特異性熒光信號(hào)。結(jié)果表明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR具有良好的特異性(圖4)。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選取 1.31×108copies/μL、1.31×106copies/μL、1.31×104copies/μL、1.31×102copies/μL 4個(gè)濃度的陽(yáng)性模板進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算出組內(nèi)組間CT值的變異系數(shù)分別為0.35%～1.70%、0.32%～0.60%(表1)，均小于3%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR的重復(fù)性試驗(yàn)Table 1The reproducibility test of real-time PCR

2.6 臨床樣品的檢測(cè) 將23份臨床全血樣品分別應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR和常規(guī)PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光PCR能夠檢出12份陽(yáng)性，常規(guī)PCR只檢出7份陽(yáng)性，并且常規(guī)PCR檢出的7份陽(yáng)性樣品熒光PCR均顯示為陽(yáng)性，實(shí)時(shí)熒光PCR和常規(guī)PCR的檢出率分別為52.17%和30.43%，表明該實(shí)時(shí)熒光PCR有良好的臨床靈敏性和應(yīng)用性。

3 討論

目前，牛巴貝斯蟲病的診斷一般為血涂片鏡檢，該方法雖然方便直觀，但敏感性差，檢出率低，對(duì)低水平感染檢測(cè)不能適用；間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等血清學(xué)方法應(yīng)用較為廣泛，但存在不能區(qū)分耐過(guò)動(dòng)物、不易區(qū)分相近蟲種的交叉感染的缺點(diǎn)[11]；實(shí)時(shí)熒光PCR方法可以直接檢測(cè)病原核酸，準(zhǔn)確性高，對(duì)隱性感染和低水平感染具有良好的檢出率。實(shí)時(shí)熒光PCR主要分為染料法和探針?lè)?，探針?lè)ǖ膬?yōu)勢(shì)在于在上下游引物之間引入一條與目的模板特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記探針，增強(qiáng)了實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性和敏感性。本研究針對(duì)B.bovis 18S rRNA基因設(shè)計(jì)引物和Taq Man探針，建立了B.bovis實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，該方法最低可以檢測(cè)1.3×101copies靶基因，對(duì)低水平感染有更好的檢出率，敏感性較常規(guī)PCR高1000倍；與其他幾種牛屬動(dòng)物易感血液原蟲無(wú)交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，能夠準(zhǔn)確快速定性檢測(cè)；組內(nèi)和組間試驗(yàn)的變異系數(shù)分別為0.35%～1.70%、0.32%～0.60%，方法的穩(wěn)定性好；臨床樣品檢測(cè)表明該方法具有良好的應(yīng)用性。

綜上所述，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，可以靈敏、特異的快速定性檢測(cè)B.bovis，該方法的建立將為蜱傳原蟲病的流行病學(xué)調(diào)查提供快速有效的檢測(cè)手段，為蜱媒病的相關(guān)研究提供有效的技術(shù)支持。

[1]Homer M J,Aguilar-Delfin I,Telford SR,et al.Babesiosis[J].Clin M icrobiol Rev,2000,13(3):451-469.

[2]吳永紅，劉玲，王真，等.南疆部分散養(yǎng)戶牛場(chǎng)梨形蟲及其媒介蜱感染情況的調(diào)查[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，48(10)：1918-1922.

[3]臧鵬偉，王偉東，徐魁梧，等.南京地區(qū)新生奶牛犢的巴貝斯蟲病病例分析[J].畜牧獸醫(yī)，2007，39：41-42.

[4]Fahrimal Y,Goff W L,Jasmer,D P.Detection of Babesia bovis carrier cattle by using polymerase chain reaction amplification of parasite DNA[J].JClin M icrobiol,1992,30(6):1374-1379.

[5]AbouLaila M,Yokoyama N,Igarashi I.Development and evaluation of two nested PCR assays for the detection of Babesia bovis from cattle blood[J].Vet Parasitol,2010,172:65-70.

[6]Buling A,Criado-Fornelio A,Asenzo G,et al.A quantitative PCR assay for the detection and quantification of Babesia bovis and B.bigem ina[J].Vet Parasitol,2007,147:16-25.

[7]周霞，剡根強(qiáng).熒光定量PCR技術(shù)及其在預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，23(5)：623-627.

[8]Higgins JA,Fayer R,Trout JM,et al.Real-time PCR for the detection of Cryptosporidium parvum[J].JM icrobiol Methods,2001,47(3):323-337.

[9]王群，鄭小龍，朱來(lái)華，等.馬媾疫錐蟲SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34(9)：724-727.

[10]蔣春燕，王泰健，王琴，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26(12)：97-101.

[11]Livio M C J,Elida M L R,Olindo A M F,et al.Comparison of different direct diagnostic methods to identify Babesia bovis and Babesia bigem ina in animals vaccinated with live attenuated parasites[J].Vet Parasitol,2006,139:231-236.