高 菲，崔 文，姜艷萍，唐麗杰，葛俊偉，李一經

產腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的(Porcine post-weaning diarrhea，PWD)主要原因之一， ETEC引起腹瀉主要是通過其表面的菌毛黏附素(F4、F5、F6和F41等)吸附于腸道上皮細胞，然后產生腸毒素而致病。ETEC的菌毛和腸毒素被認為是最主要的致病因素，其中菌毛與小腸上皮結合是感染及致病的關鍵環(huán)節(jié)。阻止ETEC定殖，將有可能預防PWD的發(fā)生。

FaeG是黏附素蛋白F4的主要蛋白的亞基，位于菌毛的頂端，直接參與易感宿主腸上皮細胞大分子受體的特異性結合[1]，已成為預防PWD的疫苗候選抗原。

腸道內大多數(shù)抗原是通過M細胞轉運，其胞吞轉運作用是Peyer's結獲取抗原的主要來源。研究表明，將抗原靶向傳遞至M細胞，可以提高Peyer's結的抗原攝取量，激活更多的T、B細胞參與免疫反應。靶向肽co1能夠有效的將融合蛋白傳遞給M細胞，增強免疫反應，與LTB、CTB相比，co1對融合蛋白的大小沒有限制，不會影響抗原蛋白的正常組裝，可以重復用于免疫[2-3]。

本實驗通過PCR的方法擴增FaeG-co1融合基因，通過原核表達制備融合蛋白，免疫小鼠后，經E.coli強毒株攻毒，通過對比M細胞靶向修飾組和未修飾組IgG、sIgA抗體水平的變化及其對小鼠的免疫保護情況，檢測M細胞靶向肽co1對FaeG疫苗免疫原性的影響，為進一步研究其基因工程疫苗提供了實驗依據。

1 材料和方法

1.1 菌株和質粒 ETEC cvcc230菌株購自中國獸藥監(jiān)察所；E.coli BL21(DE3)和表達載體pET-30b由本實驗室保存；感受態(tài)JM 109和pMD18-T載體購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑 限制性核酸內切酶，Taq DNA聚合酶、dNTP、T4DNA連接酶、Protein Marker購自TaKaRa公司；小量質粒純化及膠回收試劑盒購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；氫氧化鋁膠購自哈藥集團生物疫苗有限公司；FaeG多克隆抗體由劉文鑫博士惠贈[4]；羊抗鼠HRP-IgG、HRP-IgA、羊抗雞HRP-IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗動物 體質量為18g～20g，6周齡～8周齡昆明鼠，清潔級，購自哈爾濱獸醫(yī)研究所，飼養(yǎng)于P2實驗室的動物感染室IVC中。

1.4 目的基因的克隆與鑒定 根據已發(fā)表的ETEC基因序列(CP002732)，設計并合成PCR擴增FaeG基因的上下游引物，引物序列分別是P1：5'-GGAT CCATGGATGACTGGTGA-3'(Bam HⅠ)；P2：5'-CT CGAGGTAATAAGTAATTGCT-3'(XhoⅠ)；根據報道[2]，設計合成一條編碼M細胞靶向肽co1基因序列作為引物P3：(SalⅠ)5'-GTCGACCGGCAGAGGC GACCGCGCCGGCAGCTGATGAAACGACTCGAG-3'(XhoⅠ)，用于擴增FaeG-co1融合基因。以ETEC全基因組DNA為模版，以P1和P2擴增FaeG基因，將FaeG膠回收并將其作為模版，以P1和P3作為引物擴增FaeG-co1基因。擴增條件為：95℃5m in；94℃ 40s、53℃ 40s、72℃ 60s，30個循環(huán)；72℃10min。分別將FaeG和FaeG-co1的膠回收產物克隆于pMD18-T中構建重組質粒pMD-FaeG和pMD-FaeG-co1，并進行測序鑒定。

1.5 重組菌的構建、誘導表達及鑒定 采用Bam HⅠ和XhoⅠ對pMD-FaeG和pET30b進行雙酶切，Bam HⅠ和SalⅠ對pMD-FaeG-co1進行雙酶切，回收目的片段，將目的基因亞克隆于pET-30b表達載體中，轉化至受體菌，構建重菌株pET-FaeG/BL21(DE3)、pET-FaeG-co1/BL21(DE3)。將重組菌擴大培養(yǎng)，當OD600nm約為0.4時，加IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃搖床180r/m in誘導4h，離心收集菌體進行超聲破碎，離心后收集上清與沉淀，進行SDS-PAGE分析，確定表達蛋白的存在形式。將重組菌經SDS-PAGE分析后轉印于硝酸纖維素膜，5%脫脂乳4℃封閉過夜。以FaeG多抗作為一抗，羊抗雞HRP-IgG為二抗，通過二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色進行western blot鑒定。

1.6 包涵體制備 經IPTG誘導的重組菌培養(yǎng)物離心收集菌體，重懸于50mmol/L Tris·HCl 22mmol/L EDTA中，加入溶菌酶至終濃度100μg/m L，再加入 0.5m L 1%Triton X-100，于 30℃溫育 30m in。經超聲波裂解10min后，12000r/min離心15min，收集沉淀物，重懸后備用。以提取的包涵體為材料，按Bioteke說明書純化蛋白。

1.7 小鼠最小致死劑量(MLD)的確定 用LB培養(yǎng)基將ETEC cvcc230菌液分別稀釋為1.0×107cfu/m L、5.0×107cfu/m L、1.0×108cfu/m L、5.0×108cfu/m L、1.0×109cfu/m L、5.0×109cfu/m L 6個不同濃度，分別口服接種6組小白鼠，每組5只，每只0.2m L，接種后觀察小鼠的死亡狀況，確定MLD。

1.8免疫保護性試驗 將FaeG、FaeG-co1包涵體懸液，分別加等量的氫氧化鋁膠混均后通過腹腔途徑免疫小鼠，每組10只，每只50μg，設立注射生理鹽水對照組。14d后以相同劑量和接種途徑進行加強免疫；在第二次免疫14d后，口服接種1MLD的E.coli強毒株進行攻毒試驗。攻毒后對小鼠進行監(jiān)測，統(tǒng)計其發(fā)病和死亡情況。

1.9 免疫小鼠特異性IgG、sIgA測定 分別采集免疫前、初次免疫后第7d、21d以及攻毒后第7d血液及小鼠糞便，制備血清，每0.1g糞便加入0.5m L提取液，振蕩30min，10000r/min離心5min，收集上清，采用間接ELISA方法檢測抗體效價。方法如下，以FaeG蛋白包被ELISA反應板0.1μg/孔，4℃反應過夜；洗滌3次后用含有5%脫脂乳的PBST液37℃封閉2.5h；洗滌后分別加入1∶6400稀釋的小鼠血清、處理好的糞便上清，37℃反應1h；分別加入1∶5000稀釋的羊抗鼠HRP-IgG、HRP-IgA，37℃反應1h；加OPD-H2O2底物顯色液，避光顯色10m in，加終止液測定OD490nm。

2 結果

2.1 FaeG及FaeG-co1基因的克隆與鑒定 以ETEC全基因組DNA為模板，P1、P2為引物，經PCR擴增獲得約813bp的FaeG基因，以FaeG基因膠回收產物為模版，P1和P3(co1基因序列)為引物，通過重疊延伸PCR(EOS-PCR)擴增獲得約846bp的FaeG-co1基因，經過比對與GenBank上已發(fā)表的序列的核苷酸同源性為98%～100%。

2.2 重組菌的構建、誘導表達與鑒定 分別構建重組表達質粒pET-FaeG、pET-FaeG-co1，其重組菌誘導后，經SDS-PAGE分析，表達的重組蛋白分子量分別約為34.6ku和36.8ku(圖1)。兩種重組菌表達的蛋白均主要以包涵體形式存在。Western blot鑒定結果顯示，目的蛋白可被陽性血清識別，顯示其具有良好的免疫反應性(圖2)。

2.3 免疫保護性試驗 測定用于攻毒的ETEC cvcc230菌株LD50為1.0×109cfu/m L。攻毒后對各組小鼠進行連續(xù)監(jiān)測，結果表明，非免疫攻毒對照組小鼠在第2d全部死亡；FaeG組小鼠在攻毒后第2d出現(xiàn)臨床癥狀，有2只小鼠分別在第4d、5d死亡，從7d開始臨床癥狀減輕，第12d恢復正常；FaeG-co1組小出現(xiàn)輕度的臨床癥狀，第7d恢復正常。最終統(tǒng)計保護率：FaeG組為80%(8/10)、FaeG-co1組為100%(10/10)。結果顯示co1靶向肽能夠增強FaeG-co1融合蛋白的免疫原性(圖3)。

2.4 免疫小鼠抗ETEC特異性IgG、s IgA水平對比ELISA結果顯示，各組小鼠均可在第7d檢測到有特異性IgG、sIgA抗體產生，與對照組相比差異極顯著(p<0.01)，并且FaeG-co1組與FaeG組抗體水平差異顯著(p<0.05)。FaeG-co1組在第21d與FaeG組間抗體水平差異極顯著(p<0.01)。攻毒后抗體水平明顯上升，F(xiàn)aeG-co1組與FaeG組間抗體水平差異極顯著(p<0.01)。表明co1靶向肽修飾組的可提高抗體產生水平明顯(圖4和圖5)。

3 討 論

目前，控制PWD主要依靠抗生素，然而長期依賴抗生素最終導致多重耐藥菌株的出現(xiàn)以及生產成本過高等問題。到目前為止，全球范圍內還沒有十分有效的PWD疫苗，所以如何有效的預防幼畜腹瀉成為了亟待解決的問題。

F4+ETEC感染能夠引起新生仔豬和斷奶仔豬的腹瀉和死亡。F4可以介導ETEC與小腸上皮細胞刷狀緣上的受體結合，從而使ETEC在腸道內定植并大量繁殖，引起水樣腹瀉[5]。研究表明，對母豬進行免疫可以保護初生仔豬免受感染，但這種被動免疫力在斷奶后并不能有效的抵抗病原微生物的侵襲。因此，通過疫苗免疫建立仔豬主動免疫應答對預防PWD等多發(fā)性傳染病具有重要的意義。

M細胞主要存在于派伊爾氏集合淋巴結(Payer's patches)中的濾泡相關上皮細胞、孤立淋巴結、胃腸道外的黏膜相關淋巴組織，是一種特殊的抗原轉運細胞，是啟動黏膜免疫應答的第一步[6-7]。通過將抗原靶向至M細胞可以提高抗原提呈細胞對抗原的攝取量，從而激活更多的T細胞參與免疫反應，誘導仔豬動物更早、更快的產生更強的免疫應答。

F4菌毛是F4+ETEC黏附于腸道上皮細胞的關鍵性致病因子，也是抗F4+ETEC腹瀉基因工程疫苗研制中廣泛使用的靶抗原。以純化F4菌毛蛋白[8]、重組FaeG蛋白[9]、F4蛋白腸溶微丸[10]、植物反應器表達的FaeG蛋白作為免疫原免疫哺乳仔豬[11-12]，可以誘導一定程度黏膜免疫應答和系統(tǒng)免疫應答，雖不能完全阻止感染的發(fā)生，但產生的抗體具有抗F4+ETEC黏附作用。

本研究表達的FaeG和FaeG-co1融合蛋白的包涵體分別免疫昆明鼠并進行攻毒試驗。結果表明，F(xiàn)aeG-co1融合蛋白可以有效誘導小鼠產生的特異性IgG、sIgA抗體水平，并顯著高于FaeG免疫組；而且FaeG-co1組兩次免疫后對E.coli強毒株致死劑量攻毒保護率達到100%，明顯高于FaeG免疫組的80%。結果表明，M細胞靶向肽co1在腸道外免疫也同樣具有免疫增強作用，可使動物在短時間內產生更高水平的抗體，提高免疫應答的水平，是一種極具應用前景的免疫增強分子。

蛋白的提純物可激發(fā)小鼠產生高水平保護性抗體的免疫應答，但其提純工藝較為復雜、損失率較大，不適用于大規(guī)模生產。而包涵體蛋白由于不具有天然蛋白的構象，不具有相應的蛋白生物活性，但它卻是有效的免疫原[15]，而且更利于對其進行純化[13]。實驗結果表明，用提取的包涵體直接免疫小鼠同樣獲得了理想的免疫效果。

本實驗通過co1對F4菌毛的主要亞單位FaeG進行融合表達，用氫氧化鋁作為佐劑，包涵體直接免疫動物，兩次免疫即可獲得100%的攻毒保護率，有效的提高了免疫效果，并降低了生產成本。本研究為制備防治PWD的基因工程疫苗奠定了基礎，也為研究疾病的早期免疫提供了新思路。

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