么乃全，高云航*，于 丹，張 敏，耿 磊，王全凱*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.長(zhǎng)春市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春130061；3.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

鴨疫里氏桿菌病是目前影響?zhàn)B鴨業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病，在世界各養(yǎng)鴨地區(qū)幾乎均有流行，尤其在鴨飼養(yǎng)密度高的東南亞地區(qū)，發(fā)病情況尤為嚴(yán)重[1]?？刂圃摬∽钣行У拇胧┦侨w滅活油佐劑疫苗免疫預(yù)防，對(duì)同血清型菌攻毒保護(hù)率可達(dá)100%[2]。但因其病原鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)血清型眾多及血清型間缺乏交叉保護(hù)，限制了滅活油佐劑苗的應(yīng)用，因此開(kāi)發(fā)RA的亞單位疫苗成為解決此問(wèn)題的關(guān)鍵。Camp是一種唾液酸糖蛋白，具有促進(jìn)溶血素溶血功能的作用，已被初步證明是RA可能的毒力因子，并且在各血清型菌間具有很高的同源性和保守性，在部分血清型菌株間具有反應(yīng)原性[3]。為評(píng)價(jià)該蛋白用于亞單位疫苗開(kāi)發(fā)及診斷的潛在價(jià)值，本研究以吉林奧白星鴨分離鑒定的JL-1RA的DNA為模板，克隆camp基因并進(jìn)行原核表達(dá)，利用western blot進(jìn)一步驗(yàn)證該Camp是眾多血清型RA菌株共有的具有良好反應(yīng)原性和免疫原性蛋白；同時(shí)以Camp表達(dá)蛋白為包被抗原建立間接ELISA檢測(cè)方法，為鴨RA的流行病學(xué)調(diào)查、亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)提供有效的方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及血清 血清1型鴨RA分離自吉林某鴨場(chǎng)的法國(guó)奧白星鴨，命名為JL-1；血清1、2、11型RA由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張煒博士惠贈(zèng)，血清10、17型RA由北京農(nóng)業(yè)大學(xué)蘇敬良副教授惠贈(zèng)；E.coli DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)和 pET-28a、pMD18-T載體均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；兔抗血清1、2、10、11、17型RA全菌體陽(yáng)性血清、鴨抗RA(JL-1)陽(yáng)性血清、鴨E.coli、沙門氏菌(Saimonella)、巴氏桿菌(Pasteurellosis)和鴨肝炎病毒(DHV)陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備；待檢血清采自吉林某鴨場(chǎng)；SPF鴨血清購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑 HRP標(biāo)記羊抗兔、鴨HRP-IgG、DAB顯色劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、dNTP M ixture、Bam HⅠ及XhoⅠ、蛋白質(zhì)Marker和DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；凝膠DNA回收、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的camp基因(AF202727)序列使用Primer 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物P1：5'-GCGGATCCATGAAACAAT CTATT-3'(Bam HⅠ)，下游引物 P2：5'-CGCTCGAG TTACTTTACATTTA-3'(XhoⅠ)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 camp基因的克隆及pET-camp重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以JL-1株RA基因組DNA為模板，用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。目的條帶經(jīng)凝膠DNA回收試劑盒純化回收后克隆于pMD18-T載體中，并通過(guò)Bam HⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切亞克隆于pET-28a中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-camp，將其轉(zhuǎn)化于E.coli BL21中，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 Cam p重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 采用終濃度為1mmol/L的IPTG對(duì)含有陽(yáng)性重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒的E.coli BL21誘導(dǎo)表達(dá)5h，誘導(dǎo)后菌體經(jīng)超聲裂解收集包涵體，經(jīng)處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，觀察Camp蛋白表達(dá)情況。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白用電洗脫方法進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化效果，同時(shí)測(cè)定純化蛋白濃度。

1.6 Camp表達(dá)蛋白的western blot鑒定 純化的Camp蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將表達(dá)蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，10%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，分別加入兔抗血清1、2、10、11、17型RA陽(yáng)性血清，37℃孵育1h，以羊抗兔HRP-IgG于37℃孵育1h，DAB顯色劑顯色。

1.7 間接ELISA方法的建立

1.7.1ELISA反應(yīng)體系確立將純化的Camp表達(dá)蛋白用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋不同濃度包被酶標(biāo)板，將鴨抗RA(JL-1)陽(yáng)性、陰性血清倍比稀釋進(jìn)行雙方陣試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)酶標(biāo)二抗的稀釋度進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳的抗原包被濃度、血清稀釋度及酶標(biāo)抗體工作濃度，確定最終的ELSIA反應(yīng)體系。同時(shí)參照文獻(xiàn)[4]的方法，以RA菌體超聲破碎抗原包被酶標(biāo)板建立間接ELISA。

1.7.2ELISA臨界值的確定用建立的ELISA方法對(duì)經(jīng)試管凝集檢測(cè)為陰性的50份血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出陰性血清平均OD490nm值()和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，計(jì)算公式為+3SD，得出結(jié)果即為判定血清陰、陽(yáng)性的臨界值。

1.7.3間接ELISA方法的特異性檢驗(yàn)利用建立的ELSIA 方法對(duì)鴨 E.coli、Saimonella、Pasteurellosis、DHV、RA的陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得各自O(shè)D490nm值根據(jù)臨界值判定陰、陽(yáng)性，以檢驗(yàn)ELISA方法的特異性。

1.7.4間接ELISA方法重復(fù)性檢驗(yàn)使用同一批制備的表達(dá)抗原對(duì)篩選的陽(yáng)性和陰性血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)6個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行板內(nèi)和板間重復(fù)性試驗(yàn)，測(cè)得結(jié)果經(jīng)SPSS 17.0軟件分析計(jì)算板內(nèi)和板間的變異系數(shù)(CV)，以檢驗(yàn)ELISA方法的重復(fù)性。

1.7.5間接ELISA方法臨床應(yīng)用及對(duì)比試驗(yàn)利用建立的Camp-ELSIA及RA菌體超聲破碎ELISA方法分別檢測(cè)吉林省部分鴨場(chǎng)采集的240份鴨血清樣本及12份SPF鴨血清樣本，根據(jù)臨界值判定結(jié)果，統(tǒng)計(jì)兩種方法檢測(cè)血清樣本的陽(yáng)性率，比較兩種方法符合率。2、10、11和17型RA全菌體陽(yáng)性血清均發(fā)生特異性反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 camp基因的克隆及pET-camp重組質(zhì)粒構(gòu)建應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物以RA(JL-1)基因組DNA為模板擴(kuò)增出約1000bp的目的基因片段(圖1)，與預(yù)期大小相符(1026bp)。構(gòu)建的pET-camp原核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)Bam HⅠ、XhoⅠ雙酶切和PCR鑒定，均可見(jiàn)與目的基因大小一致片段，經(jīng)測(cè)序表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，并且目的基因與GenBank中登錄的幾株RA的camp基因序列同源性達(dá)到99%。

2.2 Cam p重組蛋白表達(dá)、純化及western blot分析 pET-camp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)5h后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，在約37ku處可見(jiàn)一條清晰蛋白條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致，表明正確表達(dá)出包涵體形式的Camp蛋白。以電洗脫方法純化目的蛋白，經(jīng)測(cè)定蛋白濃度為2.5mg/m L。同時(shí)western blot分析顯示Camp蛋白與兔抗血清1、

2.3 間接ELISA方法建立

2.3.1ELISA最佳反應(yīng)體系及臨界值確定如表1所示，經(jīng)雙方陣試驗(yàn)確定Camp表達(dá)蛋白的最佳包被濃度為10μg/m L，血清最佳稀釋度為1∶100，盡管血清稀釋度1∶50時(shí)陽(yáng)性血清OD490nm值最高，但陰性血清OD490nm也相對(duì)偏高。在固定抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)后確定酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶2000時(shí)陽(yáng)性血清OD490nm最高，并且與陰性血清OD490nm差值最大。計(jì)算所檢測(cè)50份陰性血清OD490nm的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)分別為0.236和0.0452，經(jīng)公式計(jì)算為0.372，為所建立ELISA的臨界值。

表1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)確定Table 1Result of optimal antigen coating concentration and serum dilution

2.3.2特異性試驗(yàn)通過(guò)對(duì)鴨E.coli、Saimonella、Pasteurellosis、DHV、RA的陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，除RA為陽(yáng)性外，其它幾種病原陽(yáng)性血清OD490nm值均小于0.372(表2)，表明Camp蛋白與上述幾種血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn)ELISA重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，表明板內(nèi)和板間重復(fù)性檢測(cè)的變異系數(shù)均小于6%(表3)，表明所建立的ELISA檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

表2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2Result of specificity test

2.3.4臨床檢測(cè)及對(duì)比試驗(yàn)對(duì)吉林省部分鴨場(chǎng)采集240份鴨血清及12份SPF鴨血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，12份SPF鴨血清樣本均為陰性結(jié)果。240份鴨血清檢測(cè)結(jié)果如表4所示，Camp表達(dá)蛋白ELISA檢測(cè)血清抗體陽(yáng)性86份，陽(yáng)性率35.8%，RA菌體超聲破碎抗原ELISA檢測(cè)血清抗體陽(yáng)性126份，陽(yáng)性率52.5%。兩種方法的符合率為77.5%。

表4 比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果Table 4Result of comparison test

3 討 論

當(dāng)前控制鴨RA感染主要辦法是用滅活油佐劑苗進(jìn)行免疫。郭宇飛、謝永平及胡清海等均研制了鴨RA多價(jià)滅活疫苗，對(duì)同血清型菌攻擊有較好的免疫保護(hù)效果[5-7]。但鴨RA血清型較多并且缺乏交叉保護(hù)使滅活苗的應(yīng)用有很大局限性。因此，開(kāi)發(fā)RA基因工程亞單位疫苗是目前研究的重點(diǎn)。Crasta等研究表明RA中存在一種唾液酸糖蛋白(Camp因子)，與鏈球菌Camp因子具有相似的促進(jìn)溶血素溶血功能，推測(cè)是RA的毒力因子，western blot還證明Camp蛋白能夠與血清1、2、3、5、6、13、14、19型菌株Camp表達(dá)蛋白抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)[3]。本研究克隆的camp基因與公布的RA-GD、RA-CH-1及ATCC11845等序列同源性為99%，表明其在RA菌株間具有非常高的同源性，可以用于RA的鑒定。同時(shí)，western blot分析表明該蛋白還可以與10、11、17型菌株全菌體陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，進(jìn)一步表明該蛋白是眾多血清型菌所共有的，并且具有良好的免疫原性。Jiang等將Camp因子作為組分用于研制乳房鏈球菌疫苗并取得了成功[8]，因此推測(cè)RA的Camp因子也可以作為亞單位疫苗組分用于該病的防控。

本研究建立的檢測(cè)Camp的間接ELISA檢測(cè)方法，經(jīng)驗(yàn)證具有良好的特異性和重復(fù)性，與全菌體裂解抗原ELISA方法的符合率達(dá)到77.5%，但抗體陽(yáng)性檢出率顯著低于全菌體裂解抗原ELISA方法。推測(cè)其原因是Camp作為RA的毒力因子，只有活菌在感染過(guò)程中表達(dá)才能被檢測(cè)到，與方欽的研究結(jié)果具有一定的符合性[9]，提示該ELISA方法可以用于RA血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查，也為深入研究Camp提供了依據(jù)。

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