黃永春， 劉紅梅， 趙 鵬， 張 偉， 陳志永

（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191）

大孔吸附樹脂是當前微生物源天然產(chǎn)物分離技術領域發(fā)展最迅速、最活躍的分支之一，目前它已逐漸取代活性炭和氧化鋁等吸附劑，在抗生素工業(yè)中顯示出越來越重要的地位［1］。大孔吸附樹脂是一類有機高聚物吸附劑，它具有比表面積較大、交換速度較快、機械強度高、對被提取物污染小、熱穩(wěn)定好等特點［2］。利用大孔樹脂對發(fā)酵液中抗生素的吸附與解吸附過程對發(fā)酵液中目標產(chǎn)物進行分離純化，已經(jīng)成為抗生素分離純化過程中一種幾乎必不可少的程序。有文獻報道，近年來國內(nèi)應用大孔吸附樹脂進行分離、提取、濃縮、純化的抗生素涵蓋了目前已知抗生素的所有類型［3］。

發(fā)酵液中往往成分復雜，既有大量未完全利用的培養(yǎng)基成分，也存在菌株發(fā)酵過程中代謝分泌的非分離目標成分，其中許多成分都可被大孔樹脂吸附［4－5］。目前發(fā)酵液中抗菌活性成分的分離純化已經(jīng)成為制約新型農(nóng)用抗生素研發(fā)的重要瓶頸因素之一。合理優(yōu)化大孔吸附樹脂的吸附與解吸附條件，對從發(fā)酵液中分離純化抗生素具有重要意義。

本課題組在前期研究工作中分離到一株土壤稀有放線菌株 并對它的最適發(fā)酵條件進行了研究［7］。室內(nèi)及室外活性試驗研究發(fā)現(xiàn)，該菌株發(fā)酵液對多種重要植物病原真菌及細菌都具有良好抗性，具有較好的開發(fā)前景。本研究在前期研究工作基礎上，優(yōu)化了大孔吸附樹脂對發(fā)酵液的動態(tài)吸附與解吸附條件。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

試驗用農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌由本實驗室從土壤中分離得到，編號為TJ430，經(jīng)鑒定為一株卡伍爾鏈霉菌（Streptomyces cavourensis）。

抗生素活性測定指示菌：總狀毛霉（Mucor racemosus Fres.），由本實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

TJ430斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1.8%、蛋白胨0.5%、豆粕0.3%、酵母膏0.1%、CaCO30.025%、瓊脂2.0%；

TJ430發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1.8%、蛋白胨0.5%、豆粕0.3%、酵母膏0.1%、CaCO30.025%；

抗生素生物活性測定培養(yǎng)基：采用土豆培養(yǎng)基（PDA）。

1.3 大孔吸附樹脂種類及來源

工業(yè)級大孔吸附樹脂：AB－8，NAK－9，D－101，D－4020南開大學合成樹脂廠。使用前用乙醇浸泡過夜，抽濾，棄去乙醇相，用蒸餾水反復沖洗至沒有乙醇味，備用。

1.4 儀器設備

島津LC－6AD型高效液相色譜儀（HPLC），配二極管陣列檢測器（DAD），C18液相色譜柱（250mm×4.6mm×5.0μm）。液相色譜操作條件：以70%甲醇水作流動相，流速為1.2mL／min，檢測波長為254nm。

恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.5 發(fā)酵液的制備

按照譚悠久等報道的方法發(fā)酵制備［7］。

1.6 抗生素生物活性測定方法

采用管碟法［8］對發(fā)酵液中有效成分進行測定。取5000r／min離心并經(jīng)0.45μm孔徑濾膜過濾的發(fā)酵上清液或解吸附液200μL置于牛津杯中，在土豆培養(yǎng)基上以總狀毛霉為指示菌，置于恒溫培養(yǎng)箱中于25℃培養(yǎng)24h后，用直尺量取抑菌圈直徑。

1.7 大孔吸附樹脂型號篩選方法

取200mL經(jīng)5000r／min離心的發(fā)酵上清液于500mL玻璃三角瓶中，分別加入50.0g預處理好的不同型號大孔吸附樹脂并封口后，置于搖床上以150r／min振蕩吸附2h。分別取經(jīng)吸附后的發(fā)酵液按照1.6中所述方法進行生測。與原始發(fā)酵液抑菌圈直徑比較，觀察不同型號大孔吸附樹脂對發(fā)酵液中有效成分的吸附能力。

1.8 D－101型大孔吸附樹脂最佳吸附時間的研究

取200mL經(jīng)5000r／min離心的發(fā)酵上清液于500mL玻璃三角瓶中，加入50.0g經(jīng)預處理的D－101型大孔吸附樹脂，置于搖床上于室溫下以150r／min吸附，重復3次，分別于0、30、60、90、120min取發(fā)酵上清液生測，確定最佳吸附時間。

1.9 不同濃度丙酮水溶液對有效成分的解吸附能力研究

分別稱取50.0g吸附有有效成分的D－101大孔吸附樹脂于500mL玻璃三角瓶中，向其中分別加入 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的不同濃度丙酮水溶液200mL，置于搖床上于室溫下以150r／min解吸附120min，每個濃度重復3次，取解吸液1.0mL于10mL小玻璃燒杯中于常溫下風干，以1.0mL甲醇復溶并經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進液相色譜測定，記錄不同濃度解吸液中有效成分的峰面積。

1.10 70%丙酮水溶液最佳解吸附時間的研究

分別稱取50.0g吸附有有效成分的D－101大孔吸附樹脂于500mL玻璃三角瓶中，向其中加入70%的丙酮水溶液200mL，封口后置于搖床上于室溫下以150r／min解吸附，重復3次，分別于0、30、60、90、120min取解吸液上清1.0mL于10mL小玻璃燒杯中于常溫下風干，以1.0mL甲醇復溶并經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進液相色譜測定，記錄不同解吸時間下的有效成分峰面積。

1.11 70%丙酮水溶液最佳解吸附pH的研究

分別稱取50.0g吸附有有效成分的D－101大孔吸附樹脂于500mL玻璃三角瓶中，向其中加入200mL濃度為70%的丙酮水解吸液，在pH計監(jiān)控下分別調(diào)節(jié)解吸液的pH 為2.0、3.0、4.0、自然（約6.0）、8.0、9.0、10.0，在搖床上于室溫下振蕩解吸附120min，抽濾，收集解吸液，取經(jīng)0.45μm濾膜過濾的解吸液1.0mL于10mL小玻璃燒杯中于常溫下風干，以1.0mL甲醇復溶并經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進液相色譜測定，記錄不同pH條件下解吸液中有效成分的峰面積。

2 結(jié)果

2.1 有效成分液相色譜測定條件

試驗過程中分別采用乙腈水和甲醇水作為流動相，采用本實驗室自行分離純化的純度高達98.3%的純物質(zhì)作為標準樣品對該抗生素有效成分的最佳測定條件進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當采用乙腈水做流動相時，峰形較差而且主峰與前面雜質(zhì)分離度較低，故試驗中采用甲醇水作流動相。經(jīng)過對甲醇水配比進行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，采用濃度為70%的甲醇水作流動相，流速為1.2mL／min時有效成分峰形較好，出峰時間約6.3min，而且與前面雜質(zhì)分離較好，故最終確定采用70%的甲醇水作流動相，日常檢測均在該條件下進行。

圖1 有效成分液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the active ingredients

圖2 有效成分最大吸收波長Fig.2 The maximum absorption wavelength

采用二極管陣列檢測器對有效成分主峰在190～800nm范圍內(nèi)的吸收情況進行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該成分最大吸收峰在251nm，在實際測定中采用最常用的254nm作為檢測波長。

2.2 最適大孔吸附樹脂的確定

大孔吸附樹脂的極性直接影響到對發(fā)酵液中有效成分的吸附特性，因此不同化學結(jié)構(gòu)的生物活性成分最適用的大孔樹脂類型均不相同。有報道銀杏葉中總黃酮類采用X－5樹脂吸附［9］，大豆皂苷采用AB－8樹脂吸附［10］。本研究考察了 AB－8，NAK－9，D－101，D－4020共計4種大孔吸附樹脂對發(fā)酵液中有效成分的吸附效果，動態(tài)吸附2h后發(fā)酵液生測結(jié)果如表1所示。

表1 四種大孔吸附樹脂吸附剩余液生測結(jié)果1）Table 1 The bioassay results of fermentation broth adsorbed by macroporous resin

由表1可見，原始發(fā)酵液活性較強，抑菌圈直徑可達到30.0mm 以上；AB－8、NAK－9、D－40203種樹脂對發(fā)酵液中有效成分有部分吸附能力，但是吸附120min后發(fā)酵液中仍能檢測到明顯的生物活性；D－101型大孔吸附樹脂對發(fā)酵液中有效成分的吸附能力最強，吸附120min后發(fā)酵液中已經(jīng)檢測不到生物活性，因此最終確定D－101型樹脂作為最佳吸附樹脂。

2.3 最佳吸附時間

分別間隔30min吸取D－101型大孔樹脂吸附剩余發(fā)酵液生測，以吸附時間為橫坐標，抑菌圈直徑為縱坐標作圖如圖3所示。

圖3 發(fā)酵液活性與吸附時間的關系Fig.3 The relationships between adsorption time and fermentation broth activity

由圖3可見，隨著吸附時間的延長發(fā)酵液活性迅速下降，當達到90min時發(fā)酵液已經(jīng)檢測不到活性，為保險起見試驗中將吸附時間設定為120min。

2.4 最佳解吸液濃度的確定

試驗過程中考察了10%～100%濃度范圍內(nèi)丙酮水溶液對大孔樹脂的解吸附能力，以丙酮水濃度為橫坐標，以解吸液中有效成分的峰面積為縱坐標作圖，如圖4所示。

圖4 丙酮濃度對解吸能力影響Fig.4 The effects of acetone concentration on desorption ability

由圖4可見，當丙酮濃度低于40%時，不能從大孔樹脂上將有效成分解吸下來；當丙酮濃度高于40%時有效成分開始被解吸下來；當丙酮濃度達到70%時，解吸液中有效成分含量達到最高，但是繼續(xù)增加丙酮濃度并未繼續(xù)提高解吸液中有效成分濃度。因此從節(jié)省有機溶劑用量方面考慮最終選擇70%丙酮水作為解吸附劑。

2.5 最佳解吸附時間的確定

試驗過程中考察了70%丙酮水溶液的最佳解吸附時間。每間隔30min取樣進液相色譜對有效成分濃度進行檢測，以解吸附時間為橫坐標，以有效成分峰面積為縱坐標作圖，如圖5所示。

圖5 解吸液中有效成分隨時間變化規(guī)律Fig.5 Variation of active ingredients in desorption solution

由圖5可見，隨著解吸時間的延長，解吸液中有效成分含量逐漸增加，當達到120min以后隨著時間延長解吸液中有效成分含量幾乎不再變化，因此最終確定以120min作為最佳解吸時間。

2.6 最佳解吸pH的確定

試驗過程中考察了70%丙酮水在pH＝2.0～10.0范圍內(nèi)的解吸附能力。用液相色譜對解吸附120min時解吸液中有效成分含量進行測定，結(jié)果如圖6所示。

圖6 pH對解吸能力的影響Fig.6 The effects of pH on desorption ability

由圖6可見，當解吸液pH低于2時，70%丙酮水溶液不能對D－101型大孔吸附樹脂形成有效解吸附，解吸液中未檢測到有效成分存在。當pH升高時70%丙酮水溶液的解吸能力迅速上升，當達到pH＝6.0的中性條件時解吸能力達到最大，繼續(xù)升高pH解吸液中有效成分含量變化不明顯。綜合考慮到接近中性條件可省去調(diào)節(jié)溶液pH的步驟，有利于避免調(diào)酸或調(diào)堿過程中有效成分降解，最終確定以中性條件作為最佳解吸pH條件。

3 討論

發(fā)酵液中成分復雜，直接將發(fā)酵液進高效液相色譜對整個系統(tǒng)尤其對色譜柱損傷較大，因此本研究中采用生物測定與液相色譜測定相結(jié)合的方法對有效成分進行跟蹤檢測。當有效成分被吸附在大孔樹脂上以后，對有效成分而言就完成了一次極大的凈化過程，去掉了發(fā)酵液中大部分雜質(zhì)。此后，大孔樹脂解吸液經(jīng)風干、甲醇復溶并過濾后再進入高效液相色譜時對色譜系統(tǒng)的影響已經(jīng)可以控制在可接受范圍以內(nèi)。本試驗在解吸附試驗中采用了直接進液相色譜檢測的手段，不僅提高了分析速度，而且提高了檢測方法的靈敏度和準確度，為試驗結(jié)果提供了可靠的數(shù)據(jù)支撐。

發(fā)酵液中有效成分的分離純化過程關系到新型農(nóng)用抗生素研發(fā)的成敗。大孔樹脂的吸附與解吸附過程幾乎已經(jīng)成為抗生素分離純化的必備手段之一。在該過程中解吸附參數(shù)的確定尤其重要，本研究中在探討pH對解吸附過程影響時發(fā)現(xiàn)，酸性條件（pH≤2.0）下70%丙酮水溶液不能對有效成分形成解吸附，該結(jié)論對本有效成分的分離純化過程具有重要指導意義，試驗表明在pH＝2.0時本有效成分能夠穩(wěn)定存在（數(shù)據(jù)未列出），但是大孔樹脂上所吸附的大部分有色雜質(zhì)則可被有效解吸下來，經(jīng)此步驟可形成一次對有效成分的高效凈化。

大孔樹脂的吸附與解吸附過程是一次重要的分離純化過程，但是經(jīng)過該過程的凈化后解吸液中仍含有約二分之一的雜質(zhì)，要想獲得更高純度的有效成分還需結(jié)合其他方法進一步精制。

［1］ 徐素平，曹廣霞，彭遠義.抗生素分離純化技術［J］.安徽農(nóng)學通報，2009，15（7）：79－81.

［2］ 王耀偉，崔惠卿，顧覺奮.用大孔吸附樹脂JKS－30提取分離菌絲中的抗生素2809［J］.離子交換與吸附，1989，5（1），24－28.

［3］ 黎海彬，李小梅.大孔吸附樹脂及其在天然產(chǎn)物研究中的應用［J］.廣東化工，2005（3）：22－25.

［4］ Liu Jun，Luo Jianguang，Sun Yi，et al.A simple method for the simultaneous decoloration and deproteinization of the crude levan extract from Paenibacillus polymyxa EJS－3by macroporous resin［J］.Bioresource Technology，2010，101（15）：6077－6083.

［5］ Ding Zhongyang，Lu Yingjian，Lu Zhaoxin，et al.Hypoglycaemic effect of comatin，an antidiabetic substance separated from Coprinus comatus broth，on alloxan－induced－diabetic rats［J］.Food Chemistry，2010，121（1）：39－43.

［6］ 譚悠久，彭祎，黃永春.土壤放線菌的選擇性分離及其代謝產(chǎn)物抗菌活性評價［J］.植物保護，2011，37（1）：120－123.

［7］ 譚悠久，彭祎，黃永春.抗菌素430產(chǎn)生菌發(fā)酵條件研究［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學，2010，41（6）：565－568.

［8］ 李青，劉華梅，陳振民，等.管碟法測定蘇云金桿菌上清液中增效物質(zhì)含量的研究［J］.微生物學通報，2002，29（3）：73－74.

［9］ 王慧彥，陸翠云，王妍，等.X－5大孔樹脂對銀杏葉總黃酮吸附性能研究［J］.精細石油化工進展，2009，10（9）：31－35.

［10］吳方暉，李文亮，邊鳴鏑.AB－8大孔吸附樹脂純化大豆皂苷的研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2004（3）：94－96.