傅 丹，曠壽金，賀 亮，徐 暢

(1.婁底市中心醫(yī)院，湖南 婁底 417000；2.中南大學湘雅三醫(yī)院兒科，湖南 長沙40013；3.湖南省兒童醫(yī)院呼吸科，湖南 長沙 410007)

支氣管哮喘(Bronchial Asthma,Asthma)是兒童最常見的慢性疾病之一。其主要特征是慢性氣道炎癥與氣道重塑。氣道平滑肌的過度增生、肥大細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的降解與沉積失衡是氣道重塑的重要特征[1]?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs) 是ECM 代謝的主要限速酶，在氣道重塑中起重要作用。損傷的氣道上皮表達高水平的MMP-2，可促進其下方的成纖維細胞(fibroblast,FB)增殖[2]。FB 可分泌MMPs 及其組織抑制劑-基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1 (tissue inhibitor of matrix metallo-proteinases-1,TIMP-1)[3-4]。有文獻報道，氣道重塑中存在MMP 與TIMP表達上調，MMP/TIMP 比值和氣道重塑的嚴重程度呈正相關[5]。白細胞介素21(interleukin21,IL-21)是一個具有多功能、多效性的細胞因子，屬于IL-2 超家族，其廣泛參與了人的免疫調節(jié)[6]，在自身免疫性及變態(tài)反應性疾病的發(fā)生中起著重要作用。有學者對炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的研究發(fā)現(xiàn)，IL-21 能促進腸FB 分泌MMP-2[7]。IL-21 還能降低血漿IgE的水平，哮喘發(fā)作期患兒外周血IL-21的水平低于哮喘緩解期與健康兒童[8-9]。但IL-21 在不同的免疫背景下，表現(xiàn)不同的作用。在哮喘這一免疫環(huán)境下，IL-21 能否影響FB 合成、分泌MMP，改變MMP/TIMP 比值而參與氣道重塑，目前無相關研究。本研究擬建立小鼠哮喘模型，觀察哮喘小鼠小氣道及肺組織中IL-21、MMP-2 及TIMP-1的表 達；探 討IL-21 能 否 對MMP-2的分泌產生影響，能否改變MMP-2/TIMP-1比值；吸入布地奈德能否對IL-21 水平產生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

36 只雌性清潔級、周齡7～8 周、體重18～22g、BALB/c 小鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。OVA 購自美國Sigma 公司，IL-21 單克隆抗體購自美國abcam 公司，布地奈德購自阿斯利康公司。PCR 儀由美國ABI 公司生產。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

36 只雌性BALB/c 小鼠隨機均分為3組：生理鹽水對照組(CTRL組)、OVA 致敏、激發(fā)哮喘組(OVA組)、布地奈德干預組(OVA+BUD組)。

1.2.2 哮喘模型的建立 按Jason Temelkovski等所提出的方法[9]，建立OVA 激發(fā)的小鼠哮喘模型。CTRL組小鼠以等量生理鹽水代替OVA 進行腹腔注射及霧化，OVA+BUD組小鼠在每次OVA霧化前1 h，予布地奈德1 mg 霧化30 min。在末次激發(fā)后的24 h 內取左、右肺組織。將左肺組織置于液氮中，保存于-80.0℃超低溫冰箱中待檢。將右肺組織依次行固定、脫水、包埋、切片、攤片、撈片、烘片等程序，制備肺組織標本。

1.2.3 HE、Masson 染色觀察各組小鼠小氣道及肺組織病理變化；免疫組化檢測MMP-2、TIMP-1的表達；RT-PCR 測定IL-21mRNA的表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

計量資料以均數±標準差表示。兩組間均數比較采用獨立樣本t 檢驗；多組均數比較采取單因素方差分析；相關性研究采用Pearson 相關檢驗。以P＜0.05 作為判斷差異顯著性的標準。統(tǒng)計學分析以SPSS18.0 軟件和GraphPad Prism5.0 進行分析。

2 結果

2.1 三組小鼠HE 染色、Masson 染色情況

肺組織石蠟切片HE 染色顯示OVA組小氣道及肺組織上皮細胞脫落、壞死、結構紊亂，杯狀細胞增生，氣道黏膜皺襞增多、增厚，支氣管、血管周圍炎性細胞浸潤，肺泡間隔增寬，肺泡壁變薄、甚至斷裂；Masson 染色OVA組小氣道及血管周圍可見較多膠原纖維沉積，證明哮喘小鼠模型制作成功。OVA+BUD組上述表現(xiàn)明顯輕于OVA組。CTRL組HE 染色小氣道及肺組織上皮細胞正常，支氣管、血管周圍無炎性細胞浸潤，肺泡壁完整；Masson 染色小氣道周圍無明顯膠原纖維沉積，血管周圍僅見少許膠原纖維沉積(見圖1，2)。

圖1 各組小鼠小氣道及肺組織HE 染色顯示的病理改變(×100)

圖2 各組小鼠小氣道及肺組織Masson 染色顯示的病理改變(×100)

2.2 免疫組化檢測三組小鼠MMP-2、TIMP-1 蛋白表達及MMP-2/TIMP-1 比值的比較

OVA組中MMP-2 與TIMP-1的表達、MMP-2/TIMP-1 比值，均高于CTRL組與OVA+BUD組，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；CTRL組與OVA+BUD組比較，其差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖3、4，表。

圖3 各組小鼠小氣道及肺組織MMP-2 蛋白表達情況(×100)

表1 各組小鼠小氣道及肺組織MMP-2、TIMP-1、MMP-2/TIMP-1 比值棕黃色染色區(qū)域所占鏡下面積的比值比較(n=12)

圖4 各組小鼠小氣道及肺組織TIMP-1 蛋白表達情況(×100)

2.3 RT-PCR 檢測三組小鼠小氣道及肺組織IL-21mRNA的表達

以GAPDH 為內參，以IL-21mRNA 與GAPDH灰度值比值的平均值來反映IL-21mRNA的表達水平。OVA組IL-21mRNA的表達水平低于CTRL組與OVA+BUD組，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；CTRL組高于OVA+BUD組，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖5，表2。

圖5 各組小鼠小氣道及肺組織IL-21 mRNA的表達

表2 各組小鼠小氣道及肺組織IL-21mRNA表達比較(n=12)

2.4 相關性分析結果

以各組小鼠小氣道及肺組織中IL-21mRNA的灰度值比為橫坐標，分別以MMP-2 染色陽性區(qū)域所占鏡下面積的比值為縱坐標，行線性相關分析，兩者呈負相關(r=-0.713，P＜0.01)；以TIMP-1染色陽性區(qū)域所占鏡下面積的比值為縱坐標，兩者呈負相關(r=-0.770，P＜0.01)；以MMP-2/TIMP-1 比值為縱坐標，兩者呈負相關(r=-0.729，P＜0.01)。

3 討論

哮喘的發(fā)病機制復雜，目前尚未明確。多種炎性細胞(包括T、B 淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等)及其合成、釋放的多種炎性介質(如白細胞介素、組胺、白三烯及前列腺素等)均參與了哮喘的發(fā)病過程。目前研究認為，Th2 細胞分泌的一些細胞因子(如IL-2、IL-4、IL-13 等)和基質金屬蛋白酶(如MMP-2、MMP-9 等) 在哮喘的慢性炎癥和氣道重塑中起著重要的作用[11-13]。

氣道重塑是哮喘重要的病理特征之一。MMPs是一類結構具有高度同源性的內肽酶家族的總稱，其可分解ECM，在炎癥反應、細胞遷移、組織重塑、血管生成和傷口愈合等多種生理病理過程中起著重要作用[14]。MMPs 可促進上皮下FB 活化、增殖，膠原纖維大量增生，基底膜及氣道平滑肌肥厚、增殖，最終導致氣道重塑[15]。氣道重塑的過程也是MMPs 在氣道壁沉積的過程[3]?；|金屬蛋白酶-2(MMP-2)是MMPs 家族中的膠原明膠酶，既能降解變性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原明膠，又可切割天然的Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型膠原。MMP-2 可通過激活與ECM 生長有關的因子釋放，誘導細胞增殖、分化而參與氣道重塑；同時還可降解血管及上皮下膠原成分，促進新的血管及上皮形成，導致氣道纖維化。TIMP 是目前研究發(fā)現(xiàn)的MMPs 活性的主要抑制劑之一，有TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 及TIMP-4 四型。其通過與MMPs的催化位點相結合，使其失活，或與酶原的某些位點相結合，阻礙其繼續(xù)活化的方式來調控MMPs的活性[3]。

MMP-2 在氣道與肺組織中表達上調、與其抑制物TIMP的比值失衡是導致哮喘氣道重塑的原因之一[16-17]。本研究通過建立小鼠哮喘模型，觀察哮喘小鼠小氣道及肺組織中MMP-2、TIMP-1的表達及二者的比值變化情況，發(fā)現(xiàn)小鼠被OVA 致敏、激發(fā)后，出現(xiàn)了煩躁不安、喘鳴、呼吸困難等表現(xiàn)，其小氣道及肺組織上皮細胞出現(xiàn)了結構紊亂，部分上皮細胞壞死、脫落；氣道平滑肌增生；氣道與肺組織中有較多的膠原沉積，這部分小鼠出現(xiàn)了氣道重塑；而CTRL組并未出現(xiàn)上述結構改變，提示無氣道重塑的發(fā)生；而OVA+BUD組上述改變均輕于OVA組。檢測各組的MMP-2、TIMP-1的表達及二者比值的變化發(fā)現(xiàn)，OVA組MMP-2 與TIMP-1的表達、MMP-2/TIMP-1比值均高于CTRL組和OVA+BUD組。提示MMP-2的表達上調，MMP-2 與TIMP-1 比值失衡可能在哮喘的氣道重塑中起一定作用。本研究結果還顯示，布地奈德可能通過下調MMP-2 與TIMP-1的表達，恢復MMP-2/TIMP-1的平衡來抑制氣道重塑。

IL-21 是2000年發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，為I型細胞因子[17]。它主要來源于被激活的CD4+T 細胞，而NKT 細胞、Thl7 細胞、Tfh 細胞及CD8+T 細胞被激活后或在某些特定條件下也可以產生一定量的IL-21[19-20]。IL-21 能調節(jié)T、B和NK 細胞的增殖、分化[21]。IL-21 與IL-2 超家族的其他成員(IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15) 具有共同的γ 鏈細胞因子受體γc。IL-21 與IL-2、IL4和IL-15 等一樣，信號傳導途徑均為JAK／sTAT 通路，但與其它IL-2超家族細胞因子主要激活sTAT5 途徑不同，它雖然也能激活該通路，但相對較弱，其主要的信號傳導通路為JAKl、JAK3/sTATl和sTAT3[22-23]。還有研究認為，sTATl 對細胞生長、存活主要起著負性調控，而sTAT3和sTAT5 對細胞的存活、分化則能起促進作用[24]。因此，IL-21的免疫調節(jié)作用較為復雜，既可促進又可抑制免疫反應，而其最終表現(xiàn)為促進還是抑制，則受不同免疫背景的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒血漿總IgE 水平越高，哮喘發(fā)生率越高，其病情亦越嚴重[25]。國內學者研究證實，哮喘患者外周血IL-21 水平與總IgE 水平呈負相關[26]。因此，IL-21 可能通過對IgE的負向調控，而對哮喘的發(fā)生起到一定的抑制作用。

在某些免疫環(huán)境下，IL-21 對MMP-2的分泌可起促進作用[27]。但本研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘這一免疫環(huán)境中，MMP-2的表達上調，而OVA組IL-21的表達卻低于CTRL組與OVA+BUD組，IL-21 與MMP-2的表達、MMP-2/TIMP-1 比值呈負相關。這一結果提示，在哮喘這一免疫背景下，IL-21 可能并沒有對MMP-2的分泌起到促進作用。

哮喘與過敏性鼻炎均屬于變態(tài)反應性疾病。國外學者研究發(fā)現(xiàn)，予重組鼠IL-21(recombinant mouse IL-21,rmIL-21)后，過敏性鼻炎小鼠鼻腔組織中Th2 細胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的表達水平下調[28]。予重組IL-13(rIL-13)后，哮喘小鼠氣道平滑肌和肺成纖維細胞的MMP-2mRNA表達上調[29]。因此，IL-21 可能通過調控IL-13的水平，而影響肺組織MMP-2的表達，從而影響氣道重塑。

有研究發(fā)現(xiàn)，吸入沙美特羅/氟替卡松可降低哮喘患者外周血IL-21的水平，但機制尚不明確[26]。還有學者對SLE的研究發(fā)現(xiàn)，Tfh 細胞可以產生IL-21，糖皮質激素可以通過促使Tfh 細胞的凋亡，從而降低外周血IL-21的水平[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，OVA+BUD組小氣道及肺組織IL-21表達低于CTRL組，但高于OVA組；吸入布地奈德后，IL-21的水平并沒有降低，反而有所上調。這提示在不同的免疫背景下，IL-21 扮演著不同的角色。OVA組IL-21的表達低于CTRL組與OVA+BUD組；IL-21 與MMP-2、TIMP-1的表達及MMP-2/TIMP-1 比值均呈負相關；予布地奈德干預后，可以上調IL-21的表達。這提示IL-21 可能是哮喘治療的一個潛在靶點。

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