黃美春 胡 剛 朱蕓蕓 丁慧登 魯 盈 浙江省立同德醫(yī)院腎內(nèi)科 杭州 310012

三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖作用研究

黃美春 胡 剛 朱蕓蕓 丁慧登 魯 盈 浙江省立同德醫(yī)院腎內(nèi)科 杭州 310012

目的：觀察三七總皂苷對(duì)肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子（HB-EGF）誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的作用。方法：以原代培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞為細(xì)胞模型，以400ng/mL三七總皂苷和100ng/mL HB-EGF為干預(yù)因素，實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、100ng/mL HB-EGF組和400ng/mL三七總皂苷+100ng/mL HB-EGF組，刺激系膜細(xì)胞24、36、48h，采用MTT方法，觀察三七總皂苷對(duì)重組HB-EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的作用情況。結(jié)果：HB-EGF刺激36h時(shí)，系膜細(xì)胞明顯增殖，與對(duì)照組比較，P＜0.05；三七總皂苷能抑制HB-EGF誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞的增殖，與HB-EGF組比較，P＜0.05。隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，但36h與24h比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與48h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：三七總皂苷能抑制HB-EGF誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖作用，且作用隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。三七總皂苷可能通過抑制HB-EGF對(duì)系膜細(xì)胞增殖作用而延緩腎小球硬化。

HB-EGF 系膜細(xì)胞 細(xì)胞增殖 三七總皂苷

三七屬活血化瘀藥物，中醫(yī)臨床常用于多種腎臟病的治療，并取得了一定療效。三七總皂苷是三七最主要的生物活性成分，具有抑制系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子分泌等多種作用[1]。肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子（heparin-binding epidermal growth factor like growth factor，HB-EGF）是近年來新發(fā)現(xiàn)的、國內(nèi)外研究熱門的肽類生長(zhǎng)因子，研究表明其在多種腎臟病變中起重要作用，尤其在缺血損傷腎臟病變，致腎臟病變進(jìn)展[2]。本研究觀察三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖的作用，以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)三七總皂苷治療腎臟病的作用機(jī)制，及其臨床應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 健康SD大鼠2只，體質(zhì)量150～200g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬 2003-003），飼養(yǎng)于清潔環(huán)境、溫度 20～22℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.2 藥物及試劑 三七總皂苷（云南植物藥廠）；HB-EGF（R＆D systems）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco BRL公司)；胎牛血清（FCS，杭州四季青生物技術(shù)公司）；?型膠原酶（Sigma公司）；胰蛋白酶（華美生物科技公司）；MTT試劑盒（凱基生物科技發(fā)展公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腎小球系膜細(xì)胞（glomerular mesangial cell，GMC）的原代培養(yǎng)及鑒定 系膜細(xì)胞原代培養(yǎng)和鑒定方法參見文獻(xiàn)[3]。正常SD雄性大鼠2只，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，清潔取腎，去髓質(zhì)，剁碎皮質(zhì)，經(jīng)120、80、200目篩網(wǎng)碾磨、過濾，在200目上收集腎小球，5mg/mL的Ⅳ膠原酶消化10min，洗滌后接種于含20%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基的塑料培養(yǎng)瓶中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育，當(dāng)GMC長(zhǎng)至80%融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化傳代。系膜細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行電鏡、免疫組化方法鑒定。取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的作用 應(yīng)用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、100ng/mL HB-EGF組和 400ng/mL三七總皂苷+100ng/mL HB-EGF組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。取系膜細(xì)胞，以 1×104/孔接種于 96 孔培養(yǎng)板，每孔 200μL，培養(yǎng)48h后，換用無FCS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，細(xì)胞同步化后去上清，分別加入所需濃度的2%FCS培養(yǎng)基200μL，刺激培養(yǎng)36h；同時(shí)按上述方法，三七總皂苷+100ng/mL HB-EGF 組刺激培養(yǎng) 24h、36h、48h。在結(jié)束前4h每孔加5mg/mL MTT 20μL，于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h，小心吸取上清，每孔加DMSO 200μL，震蕩10min后，490nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的作用 在刺激系膜細(xì)胞36h時(shí)，HB-EGF能刺激系膜細(xì)胞增殖，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；三七總皂苷能抑制HB-EGF誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖作用，與HB-EGF組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

表1 三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的作用（±s）

表1 三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的作用（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與 100ng/mLHB-EGF 組比較，△P＜0.05

組 別對(duì)照組100ng/mLHB-EGF 組三七總皂苷+100ng/mLHB-EGF組n/孔P值444 OD值0.4109±0.0074 0.5503±0.0061*0.4210±0.0066△0.062 0.000 0.000

3.2 不同刺激時(shí)間三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的作用 隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，但36h與24h比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；48h與36h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 不同時(shí)間三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的抑制作用（±s）

表2 不同時(shí)間三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的抑制作用（±s）

注:與 36h 比較，▲P＜0.05

時(shí)間24h 36h 48h n/孔p 444 OD值0.4247±0.0095 0.4210±0.0066 0.4031±0.0096▲0.560 0.015

4 討論

HB-EGF是1991年Higshiyame等首先發(fā)現(xiàn)的一種肽類生長(zhǎng)因子，屬于表皮生長(zhǎng)因子家族，在體內(nèi)廣泛分布，與胞膜上EGF受體緊密結(jié)合，通過PKC和Ca2+信號(hào)途徑發(fā)揮作用，參與多種病理生理過程，認(rèn)為與傷口愈合、缺血再灌注損傷、先兆子癇、哮喘、冠狀動(dòng)脈病變等多種疾病密切相關(guān)，故成為近年來國內(nèi)外研究熱點(diǎn)[4-5]。HB-EGF 在腎臟方面的研究也越來越受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，HB-EGF與多種腎小球疾病﹙尤其在缺血再灌注腎損害、系膜增生性腎炎等﹚密切相關(guān)，筆者研究發(fā)現(xiàn)HB-EGF能促進(jìn)系膜細(xì)胞增生和TGF-β的分泌和表達(dá)[6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HBEGF/EGFR通路在腎小球疾病（尤其急進(jìn)性腎小球腎炎）起關(guān)鍵作用，認(rèn)為是腎小球疾病的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)，打開了EGFR阻滯劑的臨床應(yīng)用前景[7-8]。故探討中醫(yī)藥在HB-EGF/EGFR通路的作用具有重要臨床意義。

三七具有活血化瘀作用，臨床治療慢性腎小球腎炎等多種腎臟病取得良好療效，延緩了慢性腎臟病的進(jìn)展。研究表明，三七的生物活性成分三七總皂苷能抑制系膜細(xì)胞增殖，通過抗氧化應(yīng)激抑制誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，抑制多種細(xì)胞因子分泌等作用，在抗腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化治療中具有良好療效[9]。研究證實(shí)，在腎外血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)中起重要作用，對(duì)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞有損傷修復(fù)作用，能改善人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能，減輕缺氧再給氧損傷[10]。所以，設(shè)想三七總皂苷可能對(duì)腎臟病變中HB-EGF/EGFR通路起作用，故本課題就三七總皂苷對(duì)HBEGF誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖作用方面做進(jìn)一步研究，開拓三七總皂苷在腎臟病的應(yīng)用前景。

本研究發(fā)現(xiàn)，在刺激36h時(shí)HB-EGF能刺激系膜細(xì)胞增殖（與對(duì)照組比較，P＜0.05）；三七總皂苷能抑制HB-EGF誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖作用（與HBEGF組比較，P＜0.05）。在不同刺激時(shí)間，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，三七總皂苷對(duì)HB-EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，但36h與24h比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與 48h比較，有顯著性差異（P＜0.05）。說明三七總皂苷能抑制HB-EGF誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖作用，且隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用增強(qiáng)。故推測(cè)三七總皂苷可能通過抑制HB-EGF途徑在腎臟病治療中起重要作用。

［1］祝正明，孫建實(shí)，趙湘.三七總皂苷對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞CTGF表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（4）：853-855.

［2］Uttarwar L，Peng F，Wu D，et al.HB-EGF release mediates glucose-induced activation of the epidermal growth factor receptor in mesangial cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2011，300（5）：921-931.

［3］諶貽璞，高進(jìn)，刑寶才，等.腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)［J］.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，21（4）：335-336.

［4］Higashiyama S，Abraham JA，Miller J，et al.A heparin-binding growth factor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF［J］.Science，1991，251：936-939.

［5］Pal Gooz1，Yujing Dang1，Shigeki Higashiyama，et al.A Disintegrin and Metalloenzyme（ADAM）17 Activation Is Regulated by a5b1 Integrin in Kidney Mesangial Cells［J］.PLoS ONE，2012，7（3）：1-9.

［6］Luo CC，Ming YC，Chao HC，et al.Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor downregulates expression of activator protein-1 transcription factor after intestinal ischemia-reperfusion injury［J］.Neonatology，2011，99（4）：241-246.

［7］Raed N，Bou Matar，Janet D.Klein,etal.Erlotinib Preserves Renal Function and Prevents Salt Retention in Doxorubicin Treated Nephrotic Rats［J］.PLoS One，2013，8（1）：54738-54746.

［8］Bollée G，F(xiàn)lamant M，Schordan S，et al.Epidermal growth factor receptor promotes glomerular injury and renal failure in rapidly progressive crescentic glomerulonephritis［J］.Nat Med，2011，17（10）：1242-50.

［9］孫文，馮麗園，趙宗江，等.三七總皂苷干預(yù)糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激及足細(xì)胞凋亡機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（5）：1062-1067.

［10］江小萍，李海全，潘少霞，等.三七總皂苷對(duì)缺氧再給氧血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子濃度及肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（4）：758-761.

Effect of Panax Notoginseng Saponins on proliferation of mesangial cell induced by HB-EGF

HUANG Meichun，HU Gang，ZHU Yunyun，et al.Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

Objective：To investigate the influence of panax notoginseng saponins（PNS） on proliferation of mesangial cell induced by heparin-binding epidermal growth factor like growth factor（HB-EGF） and its mechanism in kidney disease.Methods：The primary cultured SD rat mesangial cell were used as cell models.The cells were divided into control group，100 ng/ml HB-EGF group，and 400 ng/ml PNS+100 ng/ml HB-EGF group，and were cultured with these solutions for 24，36，and 48 h，respectively.Cell proliferation was assessed by MTT colorimetric assay.ResultsHB-EGF stimulated the proliferation of mesangial cells in 36 h（compared with control group P＜0.05）but the effect was inhibited by PNS（compared with HB-EGG group P＜0.05），and the effect of inhibition in 48 h was more obvious than that in 36 h（P＜0.05）.But no significant difference in the effect of inhibition was noted between cells treated for 36 h and 24 h（P＞0.05).ConclusionPNS can inhibit the proliferation of mesangial cells induced by HB-EGF，and the effect of inhibition gradually increases with the prolongation of the culture time.PNS may retard the development of glomerular sclerosis by inhibiting the proliferation of mesangial cells induced by HB-EGF.

HB-EGF mesangial cells cell proliferation panax notoginseng saponins

2013-06-05