楊建輝 呂建國(guó) 聶會(huì)勇 申曉東 (西安交通大學(xué)第一醫(yī)院疼痛科，陜西 西安 710061)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)的發(fā)生機(jī)制主要是抗炎因子與促炎因子失衡導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨破壞和滑膜炎癥反應(yīng)。白細(xì)胞介素(IL)-18是近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)的一種新的致炎細(xì)胞因子，其主要生物學(xué)功能為介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)，且與一些自身免疫性疾病相關(guān)〔1，2〕。氨基葡萄糖不僅可以減輕OA疼痛癥狀，同時(shí)可以延緩OA的病理改變，為改變病情藥物〔3〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察氨基葡萄糖對(duì)體外培養(yǎng)人骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中白細(xì)胞介素(IL)-18、白細(xì)胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響，探討氨基葡萄糖防治OA的作用機(jī)制，為氨基葡萄糖在臨床上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞取材與藥品 收集2010年6月至2011年3月在我院行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)或關(guān)節(jié)鏡檢查OA患者滑膜組織30例，所有患者均符合1986年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)關(guān)于OA的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)或臨床及放射學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)抽取5例用于實(shí)驗(yàn)，并簽署患者知情同意書(shū)。氨基葡萄糖(伊索佳，浙江海正藥業(yè)生產(chǎn))。

1.2 主要試劑及器材 D-Hanks液、含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液(Gibco)，0.25%胰蛋白酶(Sigma)，25 cm培養(yǎng)瓶，EP管，離心管，倒置相差顯微鏡(Olympus)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，IL-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Uscnlife Science＆Technology Company，武漢中美科技有限公司進(jìn)口組裝)，TNF-α、IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)ADL公司生產(chǎn)，天津瀚洋生物有限公司組裝)。

1.3 滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng) 主要采用的是滑膜細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)法〔4〕。用尖刀片仔細(xì)分離滑膜組織，將收集來(lái)的滑膜組織放入有磷酸鹽緩沖液(PBS)的無(wú)菌瓶?jī)?nèi)，在超凈臺(tái)內(nèi)棄去PBS，用D-Hanks液漂洗滑膜組織3次，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm的小塊，少量培養(yǎng)液濕潤(rùn)瓶底，將滑膜組織塊以間距5 mm左右放入瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放置入培養(yǎng)箱內(nèi)，待4 h后組織塊貼牢。再緩慢加入3 ml培養(yǎng)液覆蓋組織小塊。培養(yǎng)3 d后更換培養(yǎng)液，除去未貼壁的組織塊，每瓶中加入4 ml新鮮培養(yǎng)液。以后隔天換液，倒置相差顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)，待組織塊周圍細(xì)胞鋪滿50%培養(yǎng)瓶底面，置胰蛋白酶溶液37℃孵育，達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基終止消化，按1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)接種，3 d換液1次，約10 d左右可長(zhǎng)滿瓶底，此為一代滑膜細(xì)胞。待布滿培養(yǎng)瓶底面90%面積時(shí)，即可按1∶3比例再次進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用抗vimentin抗體作免疫組織化學(xué)染色、鑒定。

1.4 含藥血清和正常兔血清的制備 將氨基葡萄糖按體表面積折算動(dòng)物的等效劑量〔5〕，再用生理鹽水配成8 ml溶液給新西蘭大白兔灌胃，正常兔血清則以生理鹽水8 ml灌胃。連續(xù)2次灌胃，中間間隔2 h，在末次灌胃的3 h后，乙醚和氯胺酮復(fù)合麻醉下腹主動(dòng)脈采血，4℃冰箱過(guò)液后，離心2 500 r/min×25 min，抽取血清，56℃、30 min 滅活，經(jīng) 0.45 μm 濾膜抽濾除菌、分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 加藥培養(yǎng)及上清液收集 第一代滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔的組織細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)為1.5×105/L，培養(yǎng)48 h后，用達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)液清洗2次，吸棄孔中培養(yǎng)液，進(jìn)行試驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)分為4組:A組(對(duì)照組)每孔加入正常兔血清200 μl;B組10%含氨基葡萄糖血清200 μl;C組20%含氨基葡萄糖血清200 μl;D組40%含氨基葡萄糖血清200 μl。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)48 h，用胰蛋白酶消化細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)1 d后收集培養(yǎng)液上清，編號(hào)，－80℃保存待測(cè)，滑膜細(xì)胞作免疫化學(xué)染色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.6 ELISA檢測(cè) 將－80℃保存的細(xì)胞培養(yǎng)上清液放于冰盒完全解凍后，按ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作:加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品100 μl，注意不要有氣泡。輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋。37℃反應(yīng)120 min，棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液 A 工作液 100 μl，37℃，60 min。洗板 3 次，350 μl每孔，甩干。每孔加檢測(cè)溶液B工作液100 μl，37℃，60 min，洗板5次，甩干。依序每孔加底物溶液90 μl，37℃避光顯色30 min(此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3～4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3～4孔梯度不明顯)。依序每孔加終止溶液50 μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。用酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(A值)。

1.7 細(xì)胞免疫化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色采用SABC法，染色方法及免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均灰度值測(cè)定按文獻(xiàn)〔6〕進(jìn)行。具體方法簡(jiǎn)述如下:將對(duì)照組和各加藥組培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞，以1×104/ml接種在放有預(yù)處理蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞爬片良好長(zhǎng)成單層時(shí)，移除孔內(nèi)的液體。PBS(pH 7.2～7.6)液沖洗3次，每次2 min。防止沖洗掉貼壁的細(xì)胞。4%多聚甲醛固定，37℃，30 min。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗。分別滴加適當(dāng)稀釋(稀釋度1∶200)的一抗(兔抗人 IL-18、IL-1β和TNF-α抗體)，37℃ 2 h。PBS(pH 7.2～7.6)洗 2 min×3 次。滴加生物素化小鼠抗兔 IgG(二抗)，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗2 min×3次。滴加 SABC-AP，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×4次。顯色:用TBS(pH 9.0～9.5)按照1∶20的比例稀釋，混勻后加至蓋玻片上，37℃顯色20 min。蒸餾水洗滌。干燥后水溶性封片劑封片，顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.8 免疫組織化學(xué)圖像分析 將滑膜免疫組織化學(xué)玻片置Olympus顯微鏡下(40×)，對(duì)所測(cè)視野進(jìn)行準(zhǔn)確定位后由攝像系統(tǒng)提取數(shù)值化細(xì)胞圖像輸入HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(同濟(jì)千屏影像公司)進(jìn)行處理，每組隨機(jī)選取8個(gè)不重疊的視野進(jìn)行處理，測(cè)定免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均灰度值，灰度值越小，表明免疫組織化學(xué)反應(yīng)越強(qiáng)，反之則表達(dá)越弱。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞的觀察、鑒定 培養(yǎng)細(xì)胞相差顯微鏡下觀察:組織塊原代培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞從滑膜組織塊邊緣逸出，7～10 d后，可見(jiàn)大量的細(xì)胞從滑膜組織塊邊緣逸出，呈長(zhǎng)梭狀極像排列。大部分為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，也有部分樹(shù)突樣細(xì)胞和巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞。14～21 d形成密集的單層細(xì)胞瓶壁，部分區(qū)域呈堆積樣或漩渦狀生長(zhǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞在0.25%的胰蛋白酶作用下較易于脫離瓶壁;樹(shù)突樣細(xì)胞和巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞則難以消化，而留于母瓶中，從而獲得較單純的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。經(jīng)過(guò)2～3次傳代后培養(yǎng)的細(xì)胞，大部分為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，經(jīng)免疫組織化學(xué)鑒定可達(dá)95%以上。

2.2 ELISA法檢測(cè)各組滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18、IL-1β、TNF-α的含量 A組分別與B組、C組、D組IL-18、IL-1β、TNF-α的含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，B組與C組、B組與D組、C組與D組IL-18含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨氨基葡萄糖濃度的增加，IL-18含量逐漸降低(D組＜C組＜B組＜A組)。見(jiàn)表1。

表1 各組滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18、IL-1β、TNF-α的含量(pg/ml，±s，n=5)

表1 各組滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18、IL-1β、TNF-α的含量(pg/ml，±s，n=5)

與A組比較:1)P＜0.01;與B組比較:2)P＜0.05;與C組比較:3)P＜0.05

組別 IL-18 IL-1β TNF-α A組69.9±5.2 96.9±5.2 86.1±6.2 B組 38.4±3.51) 45.9±5.21) 43.9±2.21)C組 23.4±1.51)2) 25.6±3.21)2) 27.2±3.21)2)D組 11.4±1.51)2)3) 12.9±5.21)2)3) 11.2±1.21)2)3)

2.3 各組滑膜細(xì)胞IL-18與IL-1β、TNF-α的相關(guān)關(guān)系分析采用 Pearson相關(guān)分析，A、B、C、D 組 IL-1β、TNF-α 含量與 IL-18含量呈正相關(guān)(r=0.786，P＜0.01)。

2.4 免疫組織化學(xué)分析 IL-18、IL-1β、TNF-α陽(yáng)性結(jié)果為滑膜細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色深染粒，免疫組化陰性對(duì)照僅見(jiàn)滑膜細(xì)胞陽(yáng)性背景著色。B組、C組、D組與A組的IL-18、IL-1β、TNF-α表達(dá)率的圖像分析即陽(yáng)性細(xì)胞灰度值結(jié)果見(jiàn)表2，IL-18、IL-1β、TNF-α在A組表達(dá)率較高，于B組、C組、D組表達(dá)率相對(duì)較低，并隨著氨基葡萄糖濃度的增加表達(dá)率逐漸降低(A組＞B組＞C組＞D組)(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 各組IL-18、IL-1β、TNF-α表達(dá)的免疫組織化學(xué)灰度值(±s，n=5)

表2 各組IL-18、IL-1β、TNF-α表達(dá)的免疫組織化學(xué)灰度值(±s，n=5)

與A組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與 B組比較:3)P＜0.01，4)P＜0.05;與C組比較:5)P＜0.05

組別 IL-18 IL-lβ TNF-α A組103±13 112±16 109±15 B組 143±122) 146±112) 135±112)C組 173±121)4) 179±141)4) 172±131)4)D組 212±153)5) 221±123)5) 211±113)5)

3 討論

OA中關(guān)節(jié)軟骨在致病因素作用下被破壞后，釋放碎片進(jìn)入滑液，刺激滑膜引起滑膜炎，滑膜炎釋放炎性介質(zhì)，進(jìn)一步降解軟骨，周而復(fù)始造成惡性循環(huán)，故滑膜炎癥的存在是OA軟骨損傷及OA慢性持續(xù)化的重要原因〔7〕。Smith等〔8〕在羊 OA模型中也證實(shí)有明顯的滑膜炎病變。并有直接證據(jù)表明，滑膜炎的嚴(yán)重程度與OA的X線片分級(jí)呈明顯的相關(guān)性〔9〕。減輕滑膜炎癥的藥物可顯著改善關(guān)節(jié)的活動(dòng)度，這些都表明滑膜炎是OA病情進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。

IL-18的主要生物學(xué)功能為介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)，且與一些自身免疫性疾病相關(guān)〔10〕。Gracie等〔11〕在 OA的滑液和滑膜中測(cè)到的IL-18含量比健康人高，而且IL-18表達(dá)水平與關(guān)節(jié)炎活動(dòng)期密切相關(guān)，并通過(guò)體外單獨(dú)培養(yǎng)非OA患者及OA患者滑膜細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行IL-18檢測(cè)，證實(shí)了IL-18不僅在在OA患者滑液和滑膜組織中含量較高，在OA患者病變滑膜細(xì)胞中亦存在高表達(dá)，Joosten等〔12〕通過(guò)對(duì)關(guān)節(jié)炎滑膜組織中IL-18水平表達(dá)的研究表明，OA關(guān)節(jié)滑膜滑液中的IL-18通過(guò)直接接觸T淋巴細(xì)胞，使單核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β和TNF-α增加，其表達(dá)與IL-1、TNF-α、局部滑膜的炎癥程度有密切正相關(guān)關(guān)系，能提高和擴(kuò)增兩者水平，且與疾病急性階段相平行，表明IL-18是關(guān)節(jié)炎中最初的一種重要的細(xì)胞因子。既往的研究表明炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α在OA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，而IL-1β、TNF-α則是存在于OA軟骨和滑液中的重要炎性細(xì)胞因子，能抑制軟骨細(xì)胞增殖和代謝，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞去分化，促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解〔13〕。

氨基葡萄糖是治療OA的特異性藥物，有研究顯示氨基葡萄糖除能夠刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白多糖，參與透明質(zhì)酸和多聚氨基葡萄糖的合成外，同時(shí)具有抑制肉芽組織增生、血管滲出和細(xì)胞游離，有效改善關(guān)節(jié)炎的癥狀〔14〕。本文與Joosten等〔12〕的研究相一致，這說(shuō)明IL-18是關(guān)節(jié)炎中最初的一種重要的始動(dòng)細(xì)胞因子，氨基葡萄糖能夠下調(diào)IL-18、IL-1β、TNF-α在OA滑膜細(xì)胞中的表達(dá)，減輕滑膜炎癥，從而抑制軟骨降解，達(dá)到治療膝OA的目的。體外培養(yǎng)可以排除體內(nèi)病變時(shí)全身免疫系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)可能對(duì)IL-18、IL-1β、TNF-α分泌造成的影響，能更直接地反映在OA病變中IL-18、IL-1β、TNF-α參與了滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)的過(guò)程。

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