王成祥 韓子明

腎小管間質(zhì)纖維化(renal tubulointerstitial fibrosis，TIF)幾乎是所有慢性腎臟疾病發(fā)展的最終結(jié)局，是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因之一［1］。這個過程受許多因素影響，其發(fā)展機制涉及許多方面。近年來研究表明轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)在TIF進程中具有重要的促進作用［2］。本文旨在探討應(yīng)用水飛薊素延緩腎小管間質(zhì)纖維化可能機制?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物模型及分組 選用3月齡SD大鼠56只，體重200～250 g，隨機分為:梗阻組(24只)、治療組(24只)、假手術(shù)組(8只)。大鼠行氯胺酮50 mg/kg麻醉，取左旁正中切口剪開腹壁，以4號手術(shù)線將左輸尿管近端兩處結(jié)扎。假手術(shù)組同樣處理但不結(jié)扎。其中于術(shù)前30 min治療組開始給予水飛薊素30 mg/kg灌胃，1次/d;假手術(shù)組和梗阻組給予等量生理鹽水灌胃處理。UUO大鼠于術(shù)后第7天、14 d、21 d隨機收獲8只，假手術(shù)組于第21天一次處死。取腎臟，10%多聚甲醛固定。免疫組織化學(xué)法檢測腎臟TGF-β1的表達情況和RTPCR法檢測各組腎組織TGF-β1mRNA表達水平。實驗過程中梗阻組第14天、21 d時間點各死亡大鼠1只。

1.2 免疫組化 采用SABC法檢測腎組織中的TGF-β1，操作步驟按SABC試劑盒說明書進行。高倍鏡(×200)下在每張不包含腎小球和血管的腎小管間質(zhì)區(qū)域隨機選取10個不重疊的視野，應(yīng)用IDA-2000高清晰度數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)進行圖像采集，經(jīng)灰度變換將陽性染色區(qū)域面積與該視野總面積百分比，計算平均值作為該樣本的百分比值。

1.3 RT-PCR PCR引物合成:上海申工生物工程公司。引物序列及產(chǎn)物如下。

引物 序列產(chǎn)物長度TGF-β1 引物5'TAA TGG TGG ACC GCA ACA ACG 3' 680bp 5'CTT GCT GTA CTG TGT GTC CAG 3'β-actin引物 5'CTT TTG TGC CTT GAT AGT TC 3' 265bp 5'GAG TCC TTC TGA CCC ATA C 3'

采用凝膠成像攝片及分析用瓊脂糖凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(SYNGENE公司)在紫外光下采集圖像并分析，分析時TGF-β1與β-actin擴增條帶的吸光度值比值作為各指標(biāo)mRNA相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 腎組織免疫組化變化 假手術(shù)組腎組織微量表達TGF-β1，主要位于腎小球系膜和上皮細(xì)胞，小管主要表達于遠曲小管;梗阻組和治療組腎組織表達TGF-β1逐漸增強，遍布皮髄質(zhì)損傷的腎小管，除腎小管上皮細(xì)胞有陽性表達外，增殖的單核巨噬細(xì)胞TGF-β1亦有表達。各觀察時間點治療組較梗阻組減少(P＜0.05)。見表1。

2.2 RT-PCR結(jié)果 假手術(shù)組大鼠腎臟存在少量TGF-β1mRNA表達。UUO大鼠各組隨著病情進展，腎組織表達TGF-β1mRNA逐漸增強，高峰持續(xù)至21 d實驗結(jié)束。治療組腎臟組織表達TGF-β較梗阻組減少(P均＜0.05)，見圖1。各組在腎組織表達變化見表1。

表1 各組大鼠腎組織TGF-β1及mRNA表達(±s)

表1 各組大鼠腎組織TGF-β1及mRNA表達(±s)

注:★P＜0.05 compared with sham operated group;◆P＜0.05 compared with operated group

鼠數(shù) TGF-β1 TGF-β1 mRNA假手術(shù)組21 d 8 0.21±0.08 0.28±0.04梗阻組 7 d 8 2.24±0.21★ 0.63±0.13★14 d 7 5.43±0.18★ 0.99±0.16★21 d 7 6.08±0.12★ 1.47±0.14★治療組 7 d 8 1.34±0.22★◆ 0.47±0.08★◆14 d 8 4.19±0.21★◆ 0.68±0.11★◆21 d 8 2.0846±0.2017★◆ 0.76±0.15★◆

圖1

3 討論

水飛薊素是從水飛薊植物提取的混合物，是一種黃酮醇類化合物，主要含水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊醇等。水飛薊素作為一種傳統(tǒng)藥物曾廣泛用于防治肝臟纖維化。它主要通過下調(diào)TGF-β1在肝內(nèi)的表達，改變肝枯否細(xì)胞的功能，抑制炎癥反應(yīng)，有效阻止肝纖維化［3］。韓子明等［4］應(yīng)用水飛薊素治療大鼠腎小管間質(zhì)纖維化，明顯延緩了腎小管間質(zhì)纖維化。TGF-β1表達增加與腎間質(zhì)纖維化關(guān)系密切。本實驗研究結(jié)果顯示:梗阻組、治療組腎組織表達TGF-β1逐漸增強，遍布皮髄質(zhì)損傷的腎小管，除腎小管上皮細(xì)胞有陽性表達外，增殖的單核巨噬細(xì)胞TGF-β1亦有表達。RT-PCR結(jié)果顯示TGF-β1mRNA與蛋白表達水平在UUO大鼠術(shù)側(cè)腎臟漸進性增加的情況，反映了相似的分布變化規(guī)律。這與文獻報道相一致。經(jīng)水飛薊素治療的治療組腎臟組織各觀察時間點TGF-β1mRNA與蛋白表達均較梗阻組減少(P＜0.05)。上述說明TGF-β1在腎小管間質(zhì)纖維化中起著重要作用，水飛薊素通過下調(diào)TGF-β1的表達，延緩腎小管間質(zhì)纖維化。但是，腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)病機制十分復(fù)雜，關(guān)于水飛薊素在緩解腎小管間質(zhì)纖維化作用機制方面還有待進一步深入研究。

［1］Li M.X，Liu B.C.Epithelial to mesenchymal transition in the progression of tubulointerstitial fibrosis.Chinese Medical Journal，2007，120，1925–1930.

［2］Wynn TA.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.J Pathol.2008，214:199-210.

［3］Jeong DH，Lee GP，Jeong WI，et al.Alterations of mast cells and TGF-betal on the silymarin treatment for CCl4-induced hepatic fibrosis.World J Gastroenterol，2005，11(8):1141-8.

［4］韓子明，趙德安，趙海霞.水飛薊素對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用.實用兒科臨床雜志，2008，17:136-8.