陳曉珍，張婷婷，2，李國友，方冬梅，張國林，羅應(yīng)剛*

1中國科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041;2中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

常用中藥甘遂為大戟科植物甘遂(Euphorbia kansui T.N.Liouex T.P.Wang)的干燥塊莖，又名苦澤、干澤，因采掘時易腫手，山西俗稱“腫手花根”［1］。該藥材主要產(chǎn)于陜西、山西、河南、甘肅、河北、寧夏、內(nèi)蒙古等地。甘遂苦寒有毒，歸肺、腎、大腸經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其具有瀉水逐飲的功效，現(xiàn)代藥理研究表明其在抗腫瘤、治療重癥胰腺炎等方面具良好療效［2］，臨床常用來治療晚期食道癌、乳腺癌等惡性腫瘤以及哮喘、慢性支氣管炎等癥。甘遂植物全株有毒，尤其根毒性較大;對皮膚和粘膜有刺激作用，食用過量出現(xiàn)腹痛、下瀉、嘔吐、脫水、嚴重時呼吸困難、循環(huán)衰竭而死亡，近年來對其化學(xué)成分和藥理作用的研究不乏報道［3-5］。

NF-κB(Nuclear Factor-kappa B)是涉及機體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細胞分化和凋亡以及腫瘤生長抑制過程中信息傳遞的一類重要核因子，它在炎癥反應(yīng)以及腫瘤生長等過程中起著重要作用［6］。臨床廣泛應(yīng)用的甘遂具有明顯的毒副作用，主要表現(xiàn)在對皮膚、眼睛的刺激作用，促使炎癥發(fā)生。我們以NF-κB信號通路為炎癥測試模型，對甘遂95%乙醇提取物以及各溶劑萃取物進行NF-κB信號通路激活測試。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)激活NF-κB信號通路作用最強的部位為非極性部位，因此我們采用GC-MS技術(shù)分離、分析并鑒定了該非極性部位中的化學(xué)成分并運用峰面積歸一化法確定了各成分的相對含量。

1 材料與儀器

甘遂(產(chǎn)地:山西，生產(chǎn)批號:1005114)購于四川新荷花中藥飲片公司，由中國科學(xué)院成都生物研究所高信芬研究員鑒定為大戟科植物甘遂(Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang)的塊莖。

Hela細胞菌株購于上海工碩生物技術(shù)有限公司;pNF-κB-luc(報告基因質(zhì)粒)、pTNF-α-promoterluc(報告基因質(zhì)粒)、熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)研究所;DMEM(高糖)培養(yǎng)液為Invitrogen公司生產(chǎn)的試劑盒。

GC(Focus)-MS(Polaris Q)聯(lián)用儀(Thermo Scientific);色譜柱為ThermoTR-5ms SQC毛細管柱(30 m ×0.25 mm i.d.，0.25 μmd.f.)。

2 試驗方法

2.1 甘遂粗提物、萃取物及非極性部位的制備

將20 kg干燥的甘遂粉碎后，用95%乙醇冷浸3次，每次用乙醇60 L浸泡7 d，將三次冷浸液回收濃縮后得粗提物(915 g)。將粗提物用5 L熱水分散后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每次用溶劑5 L，分別萃取三次。將上述制備的粗提物、各溶劑萃取物用于NF-κB信號通路活性測試。

選取激活作用最強的氯仿萃取物(40 g)進行硅膠柱層析，石油醚:丙酮溶劑系統(tǒng)(10∶1、5∶1、2∶1、0∶1)為洗脫液，TLC檢測合并，得C1～C10共10個部位;將得到的各部位進行進一步的激活NF-κB信號通路測試，其中活性最強的為非極性部位C1(15 g)。

2.2 NF-κB 信號通路活性測試

本實驗以NF-κB為研究對象，將NF-κB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細胞中，再加待測樣品到細胞培養(yǎng)液中誘導(dǎo)NF-κB的表達，通過測定熒光素酶報告基因的表達情況來檢測NF-κB的表達情況。如果NF-κB的表達增強，則所測得的熒光值相對于陰性對照值大。

2.2.1 Hela 細胞的體外培養(yǎng)

細胞的體外培養(yǎng)參照ATCC公司提供的培養(yǎng)方法操作［7］。

2.2.2 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

2.2.2.1 用10%無雌激素血清-無雙抗-有酚紅的DMEM(高糖)培養(yǎng)基將Hela細胞按2.5×105個/mL密度接種于24孔板，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞融合率到70% ～90%時，進行瞬時轉(zhuǎn)染;

2.2.2.2 向 50 μL OPTI-MEM 培養(yǎng)基中加入 0.6 μgpNF-κB-luc+0.2 μg pSV-gal，混勻;將 2μL lipofectamine2000加入50 μL OPTI-MEM 培養(yǎng)基中，靜置5 min;按 DNA(μg):Lipofectamine(μL)=0.8∶2的比例，將上述質(zhì)粒溶液逐滴加入到 lipofectamine2000溶液中，再靜置20 min，形成復(fù)合物;按2.2.2.1 中每孔 100 μL 的量加入得到的復(fù)合物到上述24孔板中進行轉(zhuǎn)染共6 h即得。

2.2.3 樣品的活性檢測

2.2.3.1 Hela細胞共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒6 h后換成10%無雌激素血清-無雙抗-有酚紅的DMEM(高糖)培養(yǎng)液，加入各濃度組(1、10、100 μg/mL)樣品，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)對照組。

2.2.3.2 培養(yǎng)24小時后棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS清洗三次后每孔加入細胞裂解液150 μL。充分裂解細胞后，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管，于10000 rpm離心1 min，并將上清液轉(zhuǎn)入干凈EP管，混勻后取50 μL加入熒光素酶底物檢測熒光素酶的活性［7］。

2.2.3.3 另取 70 μL 裂解液加入 133 μL ONPG、6 μL Mg2+及400 μL PBS的混合液，混勻后37℃水浴至黃色出現(xiàn)時測OD420。所有實驗至少重復(fù)3次，每組設(shè)置3個復(fù)孔，所得結(jié)果以表示。

2.3 甘遂激活NF-κB信號通路的非極性部位化學(xué)成分的GC-MS分析

氣相色譜條件:載氣:He，1.0 mL/min;進樣口溫度:200℃;傳輸線溫度:230℃;程序升溫條件:初始溫度80℃，保持5 min后以15℃/min的速率升溫至150℃;然后以2℃/min的速率升溫至260℃;再以20℃/min的速率升溫至300℃并保持5 min;進樣量:2 μL。

質(zhì)譜條件:離子源(EI)，溫度280℃;電子能量為70 eV，掃描質(zhì)量范圍:50～500 amu。

將GC-MS聯(lián)用分析所得各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，輸入計算機譜庫(NIST02)進行檢索，對擬合指標(biāo)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)進一步確認，同時運用峰面積歸一化法對各化合物進行定量分析，計算各化學(xué)成分的相對含量。

3 結(jié)果與討論

甘遂具有明顯的皮膚刺激等毒副作用，我們推測甘遂中可能含有激活NF-κB信號通路的活性成分。首先對甘遂95%乙醇粗提物和各溶劑萃取物進行活性檢測，結(jié)果表明氯仿萃取物的活性最強(表1);將氯仿萃取物按極性大小分成10段，進一步進行活性測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非極性的第一段(C1)活性最強，其它各段也有不同程度激活NF-κB信號通路的活性(表2)。

表1 甘遂95%乙醇粗提物和各溶劑萃取物對NF-κB信號通路的激活情況Table 1 NF-κB signaling pathway activation results of 95%ethanol crude and different solvent-soluble extracts of Kansui

表2 甘遂氯仿萃取物各小段對NF-κB信號通路的激活情況Table 2 NF-κB signaling pathway activation results of sub-fractions of CHCl3-extract of Kansui

對甘遂的非極性部位C1段進行GC-MS分析，從中共分離、鑒定了56個化合物，占總量的99.72%，主要成分為脂肪酸及其衍生物(71.23%)、長鏈烷烴及其衍生物(13.73%)，還有單萜、倍半萜類(7.1%)、芳香族類(3.57%)和脂肪醛(1.12%)等(圖1，表3)。

圖1 激活NF-κB信號通路的甘遂非極性部位(C1)的GCMS總離子流圖Fig.1 GC-MS totalion chromatogramofC1 sub-fraction of CHCl3-extract of Kansui

表3 激活NF-κB信號通路的甘遂非極性部位(C1)的化學(xué)成分Table 3 Chemical constituents of C1 sub-fraction ofCHCl3extract of Kansui

11 13.80 Z，Z，Z-4，6，9-Nonadecatriene C19H34 0.09 771 12 14.71 Benzene，1，2，3，4-tetramethoxy-5-(2-propenyl)- C13H18O4 0.58 791 13 15.42 Z，Z-2，5-Pentadecadien-1-ol C15H28O 0.17 787 14 16.75 3，7-Dimethyl-6-nonen-1-ol acetate C13H24O2 0.06 796 15 17.40 Methoxyacetic acid，3-tridecyl ester C18H32O3 0.54 850 16 18.22 Icosapent C20H30O2 0.31 800 17 18.65 Ethanol，2-(octadecyloxy)- C20H42O2 0.36 782 18 20.13 Nonadecane C19H40 0.27 852 19 21.68 Oxirane，hexadecyl- C18H36O 0.39 787 20 22.57 Phenacetin C10H13NO2 0.21 999 21 23.57 Heptadecane，2，6，10，14-tetramethyl- C21H44 0.38 880 22 24.37 Heptadecane，2，6，10，15-tetramethyl- C21H44 0.29 817 23 24.75 Hexadecanoic acid，methyl ester C17H34O2 7.59 772 24 26.02 1，2-Benzenedicarboxylic acid，butyl 8-methylnonyl ester C21H32O4 0.76 775 25 27.53 Octadecanoic acid，2-(2-hydroxyethoxy)ethyl ester C22H44O4 40.84 756 26 29.55 Eicosane，7-hexyl- C26H54 0.20 812 27 31.05 9，12-Octadecadienoic acid，methyl ester，(E，E)- C19H34O2 1.51 786 28 31.35 6-Octadecenoic acid，methyl ester，(Z)- C19H36O2 3.74 839 29 31.52 cis-Vaccenic acid C20H38O2 0.34 831 30 33.40 7，11-Hexadecadienal C16H28O 0.91 839 31 33.71 Ethyl 9-cis，11-trans.-octadecadienoate C20H36O2 3.62 804 32 34.08 trans-13-Octadecenoic acid C18H34O2 9.88 778 33 34.25 11-Octadecenoic acid，methyl ester C19H36O2 0.60 793 34 34.42 Octadecanoic acid C18H36O2 0.38 791 35 36.47 Methyl 11，14-eicosadienoate C21H38O2 0.50 795 36 36.60 Heptadecane，9-hexyl- C23H48 0.19 792 37 37.56 8，11，14-Eicosatrienoic acid，methyl ester，(Z，Z，Z)- C20H34O2 0.66 770 38 38.38 Nonanoic acid，9-(3-hexenylidenecyclopropylidene)-2- C21H34O4 0.31 833 hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl ester，(Z，Z，Z)-39 41.45 9，12，15-Octadecatrienoic acid，2，3-dihydroxypropyl ester，(Z，Z，Z)- C31H64 0.22 806 40 42.96 Hentriacontane C17H32O 2.02 822 41 46.00 13-Heptadecyn-1-ol C21H44 0.34 811 42 46.73 Heneicosane C44H90 3.54 860 43 48.53 Tetratetracontane C28H58 0.48 824 44 50.35 Octacosane C28H54 2.58 842 45 52.32 Heneicosane，11-(1-ethylpropyl)- C34H70 0.72 787 46 53.87 Tetratriacontane C16H28O3 1.16 812 47 54.11 Z-(13，14-Epoxy)tetradec-11-en-1-ol acetate C27H54 0.19 795 48 55.07 Hentriacontane C25H52 0.81 811 49 57.29 Heptadecane，9-octyl- C34H70 0.77 815 50 60.62 Tetracosane，11-decyl- C20H28O6 0.50 798 51 65.28C26H28 0.29 820 52 66.20 9-Dodecyltetradecahydrophenanthrene C22H34O 0.40 726 53 66.50 5α，6α-Epoxy-3β，17-dihydroxy-16α-methylpregnan-20-one C27H42O3 0.05 780 54 66.68 Pseduosarsasapogenin-5，20-dien C28H40O4 0.10 825 55 66.95 9，12，15-Octadecatrienoicacid，2-phenyl-1，3-dioxan-5-yl ester C29H50O 1H-2，8a-Methanocyclopenta［a］cyclopropa［e］cyclodecen-11-one，1a，2，5，5a，6，9，10，10a-octahydro-5，5a，6-trihydroxy-1，4-bis(hydroxymethyl)-1，7，9-trimethyl-，(1S，1aR，2R，5R，5aR，6S，8aS，9R，10aR)-(9Cl)0.03 822

在上述鑒定的化合物中，已有研究表明不飽和 脂肪醛(Z)-7-Hexadecenal和7，11-Hexadecadienal可引起炎癥反應(yīng)，誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病和成人呼吸道窘迫癥的產(chǎn)生等［8］，這兩種醛在甘遂非極性部位的含量分別為0.21%和0.91%。該部位中還有少量致癌物質(zhì)如苯醌類衍生物和鄰苯二甲酸酯類化合物［9，10］。在甘遂非極性部位中含量最大的是脂肪酸及酯類衍生物，且以十八碳烯酸和二十碳烯酸為主。這類脂肪酸屬于多不飽和脂肪酸，是花生四烯酸的前體物質(zhì)，在體內(nèi)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)方面起著重要的作用［11］。一般認為這類成分能夠抑制炎癥因子的釋放，在抗炎方面起著積極作用。按化合物中最后一個雙鍵離甲基端的距離將不飽和脂肪酸分為n-3和n-6兩類，研究表明n-3類比n-6類抗炎作用好［12］。但也有研究表明，由于不同細胞中基因和酶的差異，導(dǎo)致花生四烯酸前體物質(zhì)代謝途徑的改變，這類化合物也可能加重炎癥反應(yīng)或者誘發(fā)炎癥產(chǎn)生［11］。我們還從甘遂非極性部位中鑒定了增加癌癥發(fā)生幾率的化合物Vaccenic acid［12］，該化合物的含量約0.34%。

4 結(jié)語

我們以NF-κB信號通路為炎癥測試模型，對甘遂95%乙醇提取物及其各溶劑萃取物進行了NF-κB信號通路激活測試。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)激活NF-κB信號通路作用最強的部位為非極性部位。采用GC-MS技術(shù)，我們從中分離、分析并鑒定了該非極性部位中的化學(xué)成分。

甘遂非極性部位含有大量促炎成分，這些成分可能激活NF-κB信號通路的表達，從而引起炎癥因子的釋放，導(dǎo)致炎癥。上述研究結(jié)果為闡明甘遂的毒效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考，為有效利用甘遂中的有效成分、祛除其毒副作用成分奠定了基礎(chǔ)。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People's Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.81-82.

2 Chen L(陳亮)，Yu ZM(于志敏).The study of the inhibitory effect of Euphorbia kansui on Hep and S180.Modern Med JChina(中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志)，2008，10(7):6-8.

3 Chen L(陳亮).In vitro experimental study of the effect of Euphorbia kansui extract on human BEL-7402.Acta Bot Boreal-Occident Sin(西北植物學(xué)報)，2008，28:1889-1892.

4 Fan XS(范欣生)，Zhu Q(朱荃)，F(xiàn)ang TH(方泰惠)，et al.Experimental observation on phlegm-removing，anti-asthmatic and anti-inflammatory actions of pill for phlegm retention.J Nanjing Univ Tradit Chin Med(南京中醫(yī)學(xué)院學(xué)報)，1992，3:152-154.

5 Ge W(葛瑋)，Ma B(馬彬)，Yang KH(楊克虎)，et al.Kansui root for treating severe acute pancreatitis:asystematic review.Chin J Evid-based Med(中國循證醫(yī)學(xué)雜志)，2009，9:964-968.

6 Smith C，Andreakos E，Crawley JB，et al.NF-kappa B-inducing kinase is dispensable for activation of NF-kappa B in inflammatory settings but essential for lymphotoxin beta receptor activation of NF-kappa B in primary human fibroblasts.J Immunol，2001，167:5895-5903.

7 Yang LJ，Chen QF，Wang F，et al.Antiosteoporotic compounds from seeds of Cuscuta chinensis.J Ethnopharmacol，2011，135:553-560.

8 Guillen MD，Goicoechea E.Toxic oxygenated alpha，beta-unsaturated aldehydes and their study in foods:areview.CritRev Food Sci，2008，48:119-136.

9 Matsumoto M，Hirata-Koizumi M，Ema M.Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health:areview of recent studies on reproduction.Regul Toxicol Pharm，2008，50:37-49.

10 Lis LB，Bakula T，Baranowski M，et al.The carcinogenic effects of benzoquinones produced by the flour beetle.Pol J Vet Sci，2011，14:159-164.

11 Stulnig TM.Immunomodulation by polyunsaturated fatty acids:mechanisms and effects.Int Arch Allergy Imm，2003，132:310-321.

12 King VR，Huang WL，Dyall SC，et al.Omega-3 fatty acids improve recovery，whereas omega-6 fatty acids worsen outcome，after spinal cord injury in the adult rat.J Neurosci，2006，26:4672-4680.