黃生高 凌天牖 鐘孝歡等

[摘要] 目的 探討壓應(yīng)力對(duì)小鼠單核細(xì)胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12（DAP12）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）表

達(dá)的影響。方法 以小鼠單核細(xì)胞RAW264.7為研究對(duì)象，采用四點(diǎn)彎曲體外細(xì)胞加載裝置加載壓應(yīng)力0、3、6、12 h，分別以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、蛋白免疫印跡法檢測(cè)DAP12、TRAP mRNA和DAP12蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果

小鼠單核細(xì)胞RAW264.7經(jīng)破骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后，體積變大，核數(shù)目增多，TRAP染色陽性。受壓應(yīng)力刺激后，DAP12、TRAP mRNA及DAP12蛋白表達(dá)隨加力時(shí)間延長(zhǎng)而增加（P<0.05）。結(jié)論 小鼠單核細(xì)胞RAW264.7經(jīng)破骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后成功向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化細(xì)胞受壓應(yīng)力刺激活化過程中存在DAP12高表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] DNAX活化蛋白12； 抗酒石酸酸性磷酸酶； 壓應(yīng)力； 破骨細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] Q 78 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.008

破骨細(xì)胞由其前體細(xì)胞分化而來，在其分化并行使功能的過程中受多條信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控。其中免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）信號(hào)傳導(dǎo)通路日益受到人們的重視。已知DNAX活化蛋白12（DNAX-activa-ting protein 12，DAP12）是骨髓來源細(xì)胞系ITAM的主要銜接蛋白，在ITAM信號(hào)通路中起著樞紐作用。但其在破骨細(xì)胞受機(jī)械力刺激后的表達(dá)及作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬探討在小鼠單核細(xì)胞株RAW264.7受壓應(yīng)力的刺激后，DAP12、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）mRNA及DAP12蛋白的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠單核細(xì)胞株RAW264.7（ATCC公司，美國），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），兔抗人

DAP12多克隆抗體、羊抗人β-actin多克隆抗體、辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG（Santa Cruz公司，

美國），小鼠重組可溶性核因子κB受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，

RANKL）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage co-

lony-stimulating factor，M-CSF）（Peprotech公司，美國），TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa TaqTM PCR

試劑套裝、高糖DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美

國），TRAP染色試劑盒（Sigma公司，美國），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司，美國），聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（Millipore公司，美國）等。

1.2 主要設(shè)備

SFEG AIR超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈公司），四點(diǎn)

彎曲體外細(xì)胞加載裝置（四川大學(xué)設(shè)計(jì)，專利號(hào)：

zL01256849.x），F(xiàn)orma Scientific CO2培養(yǎng)箱（Shellab公司，美國），Olympus IX50相差倒置顯微鏡（Oly-mpus公司，日本），Nikon YS100光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本），DU530紫外分光光度計(jì)（Backman公

司，美國），PCR system 2700型PCR擴(kuò)增儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），DYY-Ⅱ、DYY-Ⅲ型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠），GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)

（Bio-Rad公司，美國）等。

1.3 細(xì)胞分組和加力

1.3.1 加力板的準(zhǔn)備 將750 mL斜頸培養(yǎng)瓶從中間剖開，取細(xì)胞培養(yǎng)常用的底面，打磨成8.0 cm×3.0 cm大小的兩塊，周緣平滑四角圓鈍，以避免加力過程中的應(yīng)力集中。使用清水洗凈加力板，放入酸性洗液中過夜后用三蒸水反復(fù)沖洗數(shù)次，再放入75%乙醇中浸泡24 h，三蒸水浸泡12 h后在56 ℃烘箱中烤干，最后在超凈工作臺(tái)紫外消毒燈下雙面照射滅菌（各12 h）后接種細(xì)胞。

1.3.2 加力前細(xì)胞的準(zhǔn)備 將常規(guī)傳代后的RAW-264.7細(xì)胞以密度為每毫升1×104個(gè)接種于加力板上（實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)種板）。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1 d后細(xì)胞絕大部分貼壁，更換為破骨細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM全培養(yǎng)液含20 ng·mL-1的M-CSF和50 ng·mL-1的RANKL），繼續(xù)培養(yǎng)6 d。

1.3.3 細(xì)胞加力 采用四點(diǎn)彎曲體外細(xì)胞加載裝置對(duì)接種在加力板上的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行壓應(yīng)力刺激。本實(shí)驗(yàn)設(shè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組使用的壓應(yīng)力頻率為0.5 Hz，大小為2 500 μtrain，在0、3、6、12 h不同時(shí)間段，使細(xì)胞在平行于貼壁方向上發(fā)生單軸壓縮應(yīng)變；對(duì)照組不加力。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各包含3個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本，每組的3個(gè)樣本均來自同一瓶計(jì)數(shù)的細(xì)胞，以相同的細(xì)胞密度和細(xì)胞量接種在加力板上。除加力時(shí)間與是否加力影響因素外，其他條件基本一致。加力結(jié)束后分別收獲細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcrip-

tion-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)

DAP12、TRAP mRNA的表達(dá)

1.4.1 細(xì)胞總RNA的提取及純度測(cè)定 按照TRIzol試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈 取1 μg總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成20 μL cDNA第一鏈。

1.4.3 PCR擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)引物序列具體如下。DAP12上游引物序列：5-GGCTGGGATTGTTCTGGGTGAC-3，下游引物序列：5-CCGCTGATGGGCATAGAG-TGG-3。TRAP上游引物序列：5-ACACAGTGAT-GCTGTGTGGCAACTC-3，下游引物序列：5-CC-AGAGGCTTCCACATATATGATGG-3。GAPDH上游引物序列：5-AAGCCCATCACCATCTTCCA-3，下游引物序列：5-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3。

按照TaKaRa TaqTM PCR試劑盒說明生成20 μL PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增條件如下。DAP12：94 ℃預(yù)變性5 min，開始循環(huán)94 ℃ 20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃徹底延伸10 min，4 ℃保存。TRAP：94 ℃預(yù)變性5 min，開始循環(huán)94 ℃ 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃徹底延伸10 min，4 ℃保存。GAPDH：95 ℃預(yù)變性

5 min，開始循環(huán)95 ℃ 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃徹底延伸10 min，4 ℃保存。

1.4.4 PCR產(chǎn)物凝膠電泳 各取20 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠上電泳（電壓100 V），凝膠成像系

統(tǒng)照相并用Quantity one-4.0.3凝膠圖像分析軟件測(cè)量其積分光密度值（integral optical density value，

IOD）。分別計(jì)算DAP12 mRNA、TRAP mRNA與GAPDH mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳帶IOD值之比。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)DAP12蛋白的表達(dá)

首先應(yīng)根據(jù)欲分離的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小選擇適合的凝膠濃度。本研究分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%。常規(guī)提取蛋白質(zhì)，并測(cè)定濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean±SD表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠單核細(xì)胞RAW264.7的培養(yǎng)及其向破骨細(xì)

胞分化

體外培養(yǎng)的小鼠單核細(xì)胞RAW264.7在10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。以密度為每毫升1×104個(gè)進(jìn)行接種，2～12 h細(xì)胞貼壁，5～6 d細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶。倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的貼壁RAW264.7細(xì)胞大多數(shù)呈類圓形，少量細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài)，有偽足，一般含1～2個(gè)細(xì)胞核（圖1）。加入破骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d后，可見多核細(xì)胞，胞內(nèi)有3～7個(gè)核，細(xì)胞大小不一，形態(tài)各異，TRAP染色陽性；培養(yǎng)第7天，TRAP染色陽性多核細(xì)胞增多，體積增大，核數(shù)目增多，表明RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化（圖2）。

2.2 力刺激對(duì)RAW264.7細(xì)胞DAP12、TRAP mRNA

表達(dá)的影響

2.2.1 RNA純度和電泳結(jié)果 采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA的純度，A260 nm/A280 nm比值均在1.7～2.0，顯示RNA的純度較高。瓊脂糖凝膠電泳顯示28S、18S和5S 3條帶，無明顯雜帶（圖3）。

2.2.2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 受壓應(yīng)力刺激后，實(shí)驗(yàn)組DAP12、TRAP mRNA表達(dá)隨加力時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，對(duì)照組無明顯變化（圖4）。隨著壓應(yīng)力刺

激時(shí)間的延長(zhǎng)，RAW264.7細(xì)胞DAP12 mRNA表達(dá)逐漸增加，3 h時(shí)增加不明顯，6 h后開始顯著增加。實(shí)驗(yàn)組加力6、12 h與加力0 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；加力6、12 h，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖5）。刺激3 h后TRAP mRNA表達(dá)雖然輕微上調(diào)，但無顯著差別，隨著壓應(yīng)力刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，TRAP mRNA表達(dá)逐漸升高（6、12 h）。實(shí)驗(yàn)組加力6、12 h與0 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），加力6、12 h，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖6）。

2.3 壓應(yīng)力刺激對(duì)RAW264.7細(xì)胞DAP12蛋白表達(dá)

的影響

壓應(yīng)力刺激RAW264.7細(xì)胞3 h后，DAP12蛋白表達(dá)水平增加并不明顯，隨著壓應(yīng)力刺激時(shí)間的延長(zhǎng)（6、12 h），DAP12蛋白表達(dá)水平逐漸增高。實(shí)驗(yàn)組加力6、12 h與0 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<

0.05），加力6、12 h，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖7、8）。

3 討論

3.1 細(xì)胞和應(yīng)力加載裝置的選擇

體外培養(yǎng)原代的破骨細(xì)胞難度很大，成功率較低。小鼠單核細(xì)胞RAW264.7在適宜濃度的破骨細(xì)胞培養(yǎng)液作用下，可分化成多核的、TRAP染色陽性的、具有骨吸收功能的破骨細(xì)胞。重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定[1-2]。本實(shí)驗(yàn)參考國內(nèi)外學(xué)者的培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，采用20 ng·mL-1的M-CSF和50 ng·mL-1的RANKL聯(lián)合培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，可誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，能較好地滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞量要求較大，且細(xì)胞貼壁良好，符合實(shí)驗(yàn)中需加力的要求。

人體日常活動(dòng)引起骨骼細(xì)胞的應(yīng)變約為400～

2 000 μstrain，而在劇烈活動(dòng)時(shí)細(xì)胞的應(yīng)變約為

4 000 μstrain[3]。本實(shí)驗(yàn)采用2 500 μstrain的應(yīng)變符合體內(nèi)細(xì)胞的生理應(yīng)變范圍。除了應(yīng)變大小之外，機(jī)械外力刺激的頻率也可對(duì)骨骼細(xì)胞產(chǎn)生影響[4-5]，本實(shí)驗(yàn)采用0.5 Hz頻率的壓應(yīng)力可盡量的減少加力過程中培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的流體剪切力[2]。四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載儀采用梁變形原理，利用數(shù)控步進(jìn)電機(jī)使細(xì)胞培養(yǎng)板發(fā)生應(yīng)變，使貼附在培養(yǎng)板上的細(xì)胞產(chǎn)生形變，從而間接地對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生精確、恒定的單軸應(yīng)力?？蓾M足多種應(yīng)變需求，是一種可靠且重復(fù)性較高的細(xì)胞體外力學(xué)加載儀。而且該裝置是通過細(xì)胞加力板細(xì)胞培養(yǎng)面面積的改變而對(duì)其表面培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行擠壓，故與其他一些加力裝置相比更能模擬體內(nèi)壓力側(cè)牙槽骨破骨細(xì)胞的受力情況。

3.2 壓應(yīng)力刺激對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響

TRAP是破骨細(xì)胞特有的標(biāo)志酶，是破骨細(xì)胞分化的標(biāo)記物，也與破骨細(xì)胞骨吸收功能密切相關(guān)[6-7]。

檢測(cè)TRAP的表達(dá)情況可反映RAW264.7細(xì)胞的功能狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)：在RANKL和M-CSF聯(lián)合作用下，壓應(yīng)力刺激可提高RAW264.7的破骨細(xì)胞特征，而對(duì)照組這種變化并不明顯。機(jī)械外力的這種誘導(dǎo)能力與其對(duì)細(xì)胞刺激的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，刺激時(shí)間過短，并不能引起破骨細(xì)胞的高度活化，只有機(jī)械外力刺激一定的時(shí)間后破骨細(xì)胞的活化才變得更加明顯。這與臨床上正畸牙的移動(dòng)情況有些相似，短暫的力學(xué)刺激（咬合力或短暫的正畸力等）作用于牙齒并不能引起牙齒的移動(dòng)，只有持續(xù)的正畸力才能引起牙齒移動(dòng)。

3.3 壓應(yīng)力刺激對(duì)RAW264.7細(xì)胞DAP12 mRNA和

蛋白表達(dá)的變化

破骨細(xì)胞來源于骨髓造血系統(tǒng)的單核細(xì)胞系，破骨細(xì)胞的分化與成骨細(xì)胞密切相關(guān)。成骨細(xì)胞可表達(dá)RANKL，通過細(xì)胞間接觸與破骨前體細(xì)胞胞膜上的RANK受體結(jié)合，激活RANK介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路來誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化[8]。近年來

的研究表明破骨細(xì)胞的分化除了要激活與RANKL和 M-CSF相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞膜受體及相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路外，還需要其他的信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)[9-10]。ITAM

信號(hào)傳導(dǎo)通路在骨代謝平衡或病理性骨改建（像炎

癥性骨吸收等）過程中起重要調(diào)節(jié)作用。DAP12作為ITAM信號(hào)傳導(dǎo)通路的一種主要銜接蛋白，其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路在破骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。正畸牙移動(dòng)是個(gè)炎癥反應(yīng)過程[11]，這可能引起局部

的免疫反應(yīng)。DAP12介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路作為在炎癥性骨吸收過程中發(fā)揮重要作用的信號(hào)通路是否也參與調(diào)節(jié)正畸移動(dòng)過程中牙槽骨的改建和調(diào)節(jié)機(jī)械力誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，目前尚未清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)壓應(yīng)力在刺激RAW264.7細(xì)胞后，DAP12 mRNA表達(dá)隨著壓應(yīng)力刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。表明DAP12可能參與了破骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械力刺激的應(yīng)答反應(yīng)。如前所述，2 500 μtrain的壓應(yīng)力隨著作用時(shí)間的增加可逐步上調(diào)破骨細(xì)胞分化標(biāo)記物TRAP mRNA的表達(dá)，這與DAP12 mRNA表達(dá)的趨勢(shì)類似，故筆者推測(cè)DAP12可能參與調(diào)節(jié)機(jī)械壓應(yīng)力誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的破骨細(xì)胞表征的過程。mRNA是從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究，它并不能完全體現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，對(duì)蛋白質(zhì)的研究更能闡明各種生理或病理?xiàng)l件下生命現(xiàn)象的變化機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在受到壓應(yīng)力刺激3 h后，DAP12蛋白表達(dá)水平增加并不明顯；隨著壓應(yīng)力刺激時(shí)間的延長(zhǎng)（6、12 h），DAP12蛋白表達(dá)水平逐漸增高。這與mRNA的變化基本相似。綜上所述，受到壓應(yīng)力刺激后，RAW264.7細(xì)胞DAP12 mRNA和蛋白表達(dá)發(fā)生改變，提示DAP12參與調(diào)節(jié)機(jī)械力學(xué)刺激誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化。

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（本文編輯 杜冰）