黃銳 劉鵬 肖茂德等

[摘要] 目的 比較羥磷灰石（HA）、氫氧化鈣（CH）、Vitapex誘導(dǎo)犬年輕恒牙根尖形成的效果。方法 選用2只5～6月齡犬的16顆恒切牙，去髓后隨機(jī)分為4組。A、B、C組為實(shí)驗(yàn)組，依次用HA、CH及Vitapex糊劑充填根管；D組為對照組，用AH plus糊劑充填。采用錐形束CT（CBCT）測量牙根長度及根尖面積的變化；制作石蠟切片行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察根尖組織形態(tài)；制作冰凍切片行堿性磷酸酶（ALP）染色，觀察細(xì)胞的成骨活性。結(jié)果 1）CBCT結(jié)果顯示：術(shù)后4周，各組牙根均較術(shù)前延長（P<0.05），3個實(shí)驗(yàn)組的根尖面積較術(shù)前縮小（P<0.05）；術(shù)后8周，各組根尖均顯示高密度閉合影像。2）組織切片顯示：各組根尖均無炎癥反應(yīng)；術(shù)后4周，根尖均未閉合，但有牙骨質(zhì)及牙周膜伸入根管；術(shù)后8周，A組根尖被完整的牙骨質(zhì)屏障封閉，ALP陽性細(xì)胞分布集中，B、C組牙骨質(zhì)屏障內(nèi)有間隙，牙周膜伸入其中，ALP陽性細(xì)胞散在分布，D組根尖仍有稀疏牙骨質(zhì)和類牙骨質(zhì)沉積，并有纖維及血管組織增生，ALP陽性細(xì)胞不明顯。結(jié)論 經(jīng)去髓后的年輕恒牙在無感染時牙根能繼續(xù)發(fā)育，牙周膜可能是其發(fā)育的組織來源；HA誘導(dǎo)根尖形成的速度較快，是一種理想的根尖誘導(dǎo)材料。

[關(guān)鍵詞] 根尖誘導(dǎo)； 錐形束CT； 羥磷灰石； 堿性磷酸酶； 牙周膜

[中圖分類號] R 781.34 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.012

年輕恒牙的牙根在牙髓感染或根尖感染后可停止發(fā)育。根尖誘導(dǎo)成形術(shù)是在消除感染的基礎(chǔ)上，用藥物誘導(dǎo)根尖周硬組織形成并使牙根繼續(xù)發(fā)育的方法[1]，而尋找理想的誘導(dǎo)藥物則是人們一直研究

的課題。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是牙齒、骨等硬組織形成、再生的重要礦化酶，其活性強(qiáng)弱反應(yīng)了組織的成骨能力[2]，而冰凍切片ALP染色是觀察組織中ALP活性的經(jīng)典方法。本研究擬通過錐形束CT（cone beam CT，CBCT）影像學(xué)觀察、組織形態(tài)學(xué)及酶組織化學(xué)等方法對比幾種常見根尖誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)犬根尖形成的效果，探討牙根繼續(xù)發(fā)育的可能機(jī)制，為臨床根尖誘導(dǎo)成形術(shù)中選用有效的藥物提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要設(shè)備及材料

KaVo 3D-eXam型CBCT；納米級羥磷灰石（hy-droxyapatite，HA）粉劑（AMRESCO公司，美國），甘油（分析純，鄭州化工試劑二廠），氫氧化鈣（calcium

hydroxide，CH）糊劑（含散劑和液劑，湖北泰辰健瑞藥業(yè)有限公司），Vitapex糊劑（日本森田株式會社），AH plus糊劑（Densply公司，美國）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

5～6月齡健康雜種犬2只（由重慶醫(yī)科大學(xué)動物

實(shí)驗(yàn)中心提供），分別命名為甲、乙犬，雌雄各1只，體重分別為6.8、7.2 kg。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)用糊劑的制備 HA：納米級HA粉劑和甘油按等體積比混合調(diào)成糊狀；CH、Vitapex、AH plus糊劑等按廠家說明使用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動物的處理 1）術(shù)前觀察：甲、乙犬分別拍攝CBCT片，證實(shí)兩只犬共16顆恒切牙根尖均未發(fā)育完全，測量牙根長度及根尖面積。2）根管預(yù)備及充填：用速眠新Ⅱ按0.1 mL·kg-1肌注麻醉動物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%氯己定沖洗口腔，將16顆恒切牙進(jìn)行根管預(yù)備，然后隨機(jī)分成A、B、C、D共4組，分別充填HA、CH、Vitapex、AH plus，最后用玻璃離子水門汀充填。3）甲犬的術(shù)后處理：術(shù)后4周拍攝CBCT片，測量牙根長度及根尖面積，隨即麻醉下處死，取實(shí)驗(yàn)區(qū)域牙及頜骨，經(jīng)4 ℃固定、脫鈣、脫水、包埋后以根尖孔為中心制作石蠟連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅（hematine-eosin，HE）染色。4）乙犬的術(shù)后處

理：分別于術(shù)后4、8周拍攝CBCT片，測量術(shù)后4周牙根的長度及根尖面積；術(shù)后8周處死動物，4個標(biāo)本按甲犬的處理方法制片行HE染色，另外4個標(biāo)本按杜卓民法[3]制作冰凍切片行ALP染色。

1.4 觀察方法及內(nèi)容

1.4.1 CBCT影像學(xué)觀察 采用掃描的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建，獲得實(shí)驗(yàn)牙區(qū)域多層面的軸位、矢狀位及冠狀位圖像。以右上頜中切牙為例（圖1），分別調(diào)

節(jié)其軸位、矢狀位及冠狀位的x、y坐標(biāo)軸，其交點(diǎn)O為根尖位置，從矢狀位測量牙根長度，并在根尖處沿與牙根長軸垂直的方向做切面，獲得根尖部位的橫斷面形態(tài)，利用軟件中的亨氏單位（hounsfield unit，HU）統(tǒng)計(jì)功能，從橫斷面測量根尖面積。

1.4.2 組織學(xué)觀察 各組的HE染色樣本用于觀察根尖大體形態(tài)及根尖區(qū)細(xì)胞的組成及分布，ALP染色樣本用于觀察根尖周區(qū)域ALP陽性細(xì)胞（細(xì)胞呈黑色染色）的分布情況。所有樣本均在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)重復(fù)測量3次，記錄其平均值，采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用單側(cè)配對t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CBCT觀察結(jié)果

4組牙齒術(shù)前和術(shù)后4周的牙根長度和根尖面積見表1。術(shù)后4周，4組牙齒的根尖孔均未閉合（圖2），

但牙根長度與術(shù)前相比，其變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<

0.05）。A、B、C組根尖面積的變化與術(shù)前相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而D組根尖面積的變化則無統(tǒng)計(jì)

學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后8周，因甲犬已處死，樣本量

較小，測量數(shù)據(jù)未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，但各組根尖橫斷面均顯示有密度較高的閉合影像（圖2），其中A組與B組、C組與D組的根尖幾乎分別位于同一橫斷面上，為描述方便，將A組與B組、C組與D組根尖橫斷面影像分別合并描述。結(jié)果提示，AH plus組的根尖閉合速度慢于其余3組。

2.2 組織切片觀察結(jié)果

4組牙齒的組織切片染色結(jié)果見圖3～5。術(shù)后4周，各組根尖孔均未閉合，但有牙骨質(zhì)及牙周膜伸入根管內(nèi)，僅A、B、C組可見活躍的成骨細(xì)胞及新生骨組織。術(shù)后8周，A組根尖孔封閉，根管腔和牙周膜被牙骨質(zhì)屏障隔絕，牙周膜中ALP陽性細(xì)胞呈帶狀集中分布；B、C組牙骨質(zhì)屏障內(nèi)有間隙，牙骨質(zhì)邊緣仍有成牙骨質(zhì)細(xì)胞增生，牙周膜伸入其中，并有纖維及血管組織增生，ALP陽性細(xì)胞呈散在分布；D組根尖有稀疏的牙骨質(zhì)、部分未礦化完全的類牙骨質(zhì)沉積及纖維、血管組織增生，其間仍有成牙骨質(zhì)細(xì)胞，ALP陽性細(xì)胞不明顯。另外，各組均未見炎癥細(xì)胞。根據(jù)組織切片觀察結(jié)果，可以認(rèn)為HA組根尖閉合速度最快，且與成骨相關(guān)的細(xì)胞分布較為集中。

3 討論

近年來，有學(xué)者在牙周膜組織中鑒定出了干細(xì)胞，即牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC），具有分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，成骨細(xì)胞以及分泌骨、牙骨質(zhì)、牙周膜樣組織的能力，能發(fā)揮生理性細(xì)胞更新和修復(fù)組織損傷的作用[4]。牙周膜干細(xì)

胞巢（periodontal ligament stem cell niche，PDLSCN）是PDLSC周圍的微環(huán)境，由支持細(xì)胞、基質(zhì)及生長因子等組成。生理情況下，PDLSCN中各種成分處于相對平衡穩(wěn)定的狀態(tài)，能很好地調(diào)控PDLSC的功能，但PDLSCN受到某種因素影響致使各種成分平衡打破或出現(xiàn)功能失調(diào)時，則會嚴(yán)重影響PDLSC的分化功能[5]。

從本實(shí)驗(yàn)組織切片可觀察到，根尖區(qū)牙周膜可向根管腔內(nèi)遷移并逐漸形成牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)以封閉根尖，未完全封閉的根尖可見大量纖維，推測牙周膜中的PDLSC在某種調(diào)控下分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而形成牙骨質(zhì)；同時，牙周膜中的纖維也能礦化形成類牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)而封閉根尖孔。4種材料誘導(dǎo)根尖孔閉合的速度以HA最快，AH plus最慢，造成這種差異可能是不同材料誘導(dǎo)硬組織形成的能力及對PDLSC向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的過程產(chǎn)生了不同的影響所致。

不同的材料為與之接觸的各種細(xì)胞提供了不同的細(xì)胞外基質(zhì)，從而提供了不同的刺激信號，引起細(xì)胞不同的黏附、生長及分化等功能，表現(xiàn)為細(xì)胞相容性的差異，對材料生物功能的發(fā)揮起到了重要作用[6]。

HA是牙齒的主要無機(jī)成分，是一種細(xì)胞相容性很好的材料，具有傳導(dǎo)成骨特性[6]。盧曉風(fēng)等[7]研究證實(shí)，成骨細(xì)胞能在HA/磷酸三鈣（tricalcium phos-phate，TCP）支架上很好地貼附生長，并具有較強(qiáng)的ALP活性及形成礦化的細(xì)胞外基質(zhì)等成骨表型。有學(xué)者[8]在納米HA誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞ALP表達(dá)的研究

中發(fā)現(xiàn)，納米HA與致密HA相比，具有促進(jìn)細(xì)胞在增殖早期向骨化亞群分化的作用。本研究中，HA組根尖形成最快，ALP陽性細(xì)胞分布集中，一方面是由于使用流動性較好的甘油作為溶劑，HA能在局部均勻擴(kuò)散；另一方面，HA良好的細(xì)胞相容性能聚集更多的PDLSC及成骨相關(guān)細(xì)胞，其良好的傳導(dǎo)成骨性也可使局部硬組織加快形成。

CH和Vitapex的作用機(jī)制相似，其誘導(dǎo)硬組織形成依賴局部Ca2+和OH-的濃度[9]，故其促進(jìn)礦化的作

用受到其溶解度的限制；另外，有研究[10]表明，CH解離出的OH-可改變細(xì)胞器和酶，影響細(xì)胞分裂，這可能影響本研究中CH、Vitapex組PDLSCN中細(xì)胞的生理功能，從而影響其誘導(dǎo)根尖形成的效果。

AH plus糊劑為樹脂類根管封閉劑的代表，可揮發(fā)甲醛而具有較弱的抗菌性和細(xì)胞毒性。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，0.1%的AH plus能導(dǎo)致肝細(xì)胞表面損傷甚至細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)中AH plus組根尖閉合速度最慢，可能因其細(xì)胞毒性破壞了PDLSCN對PDLSC的調(diào)節(jié)，從而延緩了該組根尖的閉合。

綜上所述，在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下，牙周膜組織可分化形成牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)封閉根尖，其效果可能主要與PDLSCN微環(huán)境密切相關(guān)，其中HA作為一種理想的新骨形成的生理基質(zhì)能較好地促進(jìn)根尖的繼續(xù)發(fā)育，可為臨床治療提供參考。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 樊明文. 牙體牙髓病學(xué)[M]. 3版. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2008：

246-247.

Fan Mingwen. Operative dentistry and endodontics[M]. 3rd ed. Bei-

jing： Peoples Medical Publishing House， 2008：246-247.

[2] Ivanovski S， Haase HR， Bartold PM. Expression of bone matrix

protein mRNAs by primary and cloned cultures of the regenera-

tive phenotype of human periodontal fibroblasts[J]. J Dent Res，

2001， 80（7）：1665-1671.

[3] 杜卓民. 實(shí)用組織學(xué)技術(shù)[M]. 2版. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 1998：

322.

Du Zhuomin. Practical histological techniques[M]. 2nd ed. Beijing：

Peoples Medical Publishing House， 1998：322.

[4] Slack JM. Stem cells in epithelial tissues[J]. Science， 2000， 287

（5457）：1431-1433.

[5] Moore KA， Lemischka IR. Stem cells and their niches[J]. Science，

2006， 311（5769）：1880-1885.

[6] 曹誼林. 組織工程學(xué)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2007：207-241.

Cao Yilin. Tissue engineering[M]. Beijing： Science Press， 2007：

207-241.

[7] 盧曉風(fēng)， 李勝富， 張杰， 等. HA/TCP雙相陶瓷與人成骨細(xì)胞生

物相容性的體外實(shí)驗(yàn)研究[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志， 2001， 18（4）：

497-499.

Lu Xiaofeng， Li Shengfu， Zhang Jie， et al. Biocompatibility of HA/

TCP biphasic ceramics with co-cultured human osteoblasts in vitro

[J]. J Biomedical Engineering， 2001， 18（4）：497-499.

[8] 孫衛(wèi)斌， 吳亞菲， 丁一， 等. 納米羥基磷灰石誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞

堿性磷酸酶表達(dá)的研究[J]. 中華口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2006， 41（6）：348-

349.

Sun Weibin， Wu Yafei， Ding Yi， et al. The expression and activity

of alkaline phosphatase in human periodontal ligament cells with

nanometer hydroxyapatite[J]. Chin J Stomatol， 2006， 41（6）：348-

349.

[9] Jaunberzins A， Gutmann JL， Witherspoon DE， et al. TGF-beta 1

alone and in combination with calcium hydroxide is synergistic to

TGF-beta 1 production by osteoblasts in vitro[J]. Int Endod J， 2000，

33（5）：421-426.

[10] Leonardo RT， Consolaro A， Carlos IZ， et al. Evaluation of cell

culture cytotoxicity of five root canal sealers[J]. J Endod， 2000，

26（6）：328-330.

[11] Huang TH， Lii CK， Chou MY， et al. Lactate dehydrogenase lea-

kage of hepatocytes with AH26 and AH plus sealer treatments[J].

J Endod， 2000， 26（9）：509-511.

（本文編輯 吳愛華）