張 堃 池艷春 郭 靜

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腎內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150001

蛋白尿是糖尿病腎?。―N）主要臨床表現(xiàn)，也是引起腎臟損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此積極探討蛋白尿的發(fā)生機(jī)制以及病理改變，對(duì)于臨床DN的防治具有重大而深遠(yuǎn)的意義。近年來，足細(xì)胞的相關(guān)蛋白分子成為研究蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展的熱點(diǎn)，而WT1也成為影響足細(xì)胞功能的重要因子，對(duì)其研究發(fā)現(xiàn)可作為判定糖尿病腎病的早期指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽?/h3>

雄性 Wistar大鼠 56只，體重 200～300 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)將其分為兩組，對(duì)照組（6只）和模型組（50只）。除對(duì)照組，其余所有大鼠均行戊巴比妥鈉腹腔麻醉（30 mg/kg）后行右腎切除術(shù)，2周后給予腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，溶于0.1 mol/L枸椽酸緩沖液中，pH=4.5，65 mg/kg）；對(duì)照組僅注射相同數(shù)量的枸椽酸緩沖液。48 h后從尾靜脈采血用微量血糖儀測定血糖，試紙法測定尿糖。連續(xù)3d空腹血糖≥16.7mmol/L，尿糖強(qiáng)陽性視為糖尿病大鼠模型成功。4周后，測定24 h尿蛋白量﹥30 mg為DN成模標(biāo)準(zhǔn)，未成功者剔除。 分別于 STZ 注射成模后第 1、2、4、8、12 周處死各模型組大鼠6只，各時(shí)間點(diǎn)大鼠處死前代謝籠內(nèi)收集24 h尿液，-20℃保存待測；處死大鼠后用生理鹽水灌冼，取左腎留取腎皮質(zhì)，一部分用于病理切片觀察和免疫組化檢查；另一部分用于Western blot檢測。對(duì)照組大鼠于第1、2、4、8、12周收集代謝籠24 h尿液測定蛋白量，12周時(shí)處死留取腎皮質(zhì)分別做上述檢測。

表1 對(duì)照組與各模型組大鼠24 h尿蛋白定量的比較（mg，±s）

表1 對(duì)照組與各模型組大鼠24 h尿蛋白定量的比較（mg，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

對(duì)照組模型組66 7.82±2.09 39.63±13.01*7.59±2.44 60.51±7.37*7.92±2.89 75.96±18.28*8.53±2.47 90.97±14.19*9.15±2.26 114.74±12.91*組別 只數(shù) 1周 2周 4周 8周 12周

1.2 儀器與試劑

STZ（美國 Sigma 公司），苯甲基磺酰氟（PMSF，美國Sigma公司），醋酸纖維膜（美國Pall公司），單克隆鼠抗WT1抗體（美國Santa公司），兔抗鼠IgG（美國Santa公司），血糖儀和試紙（美國強(qiáng)生公司），二辛可寧酸（BCA）蛋白檢測試劑盒（美國Pierce公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），組織勻漿機(jī)（德國Heidolph公司），Singmal-15K型低溫高速離心機(jī) （德國EPPENDORF公司），紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司），BIORAD GS-800圖像分析系統(tǒng) （美國Bio-Rad公司），X-光膠片（美國柯達(dá)）。

1.3 檢測項(xiàng)目

1.3.1 24 h尿蛋白定量 各組大鼠在處死前收集代謝籠內(nèi)24 h尿液測定尿蛋白量，取4 mL尿液，2000 r/min離心10 min，去除沉渣并于-20℃保存，采用BCA法檢測24 h尿蛋白量。

1.3.2 腎臟組織學(xué)檢查 ①組織學(xué)采用光學(xué)顯微鏡觀察：脫蠟和水化、蘇木素染色、伊紅染色、復(fù)染、常規(guī)脫水、封片、鏡檢。②新鮮組織經(jīng)固定，脫水，石蠟包埋進(jìn)行免疫組化檢查，WT1定位。

1.3.3 Western blot 將大鼠的腎臟組織剪碎，冰上稱取大鼠腎皮質(zhì) 100 mg，加入 400 μL（含 PMSF）裂解液于勻漿器中進(jìn)行勻漿，然后置于冰上經(jīng)勻漿器和裂解儀和勻組織，提取蛋白，Braford法測定蛋白濃度。將組織液與緩沖液一起加熱、上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜、抗體雜交、顯影、洗膜、孵育、曝光、定影后得到蛋白印跡，并用考馬斯亮藍(lán)法測定吸光光度值，內(nèi)參為β-actin，從而確定WT1的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)較好，無多食、多尿、多飲，均成活無死亡。造模成功后，模型組大鼠精神狀態(tài)較萎靡，毛色晦暗無光澤，活動(dòng)少反應(yīng)較差，多食、多尿、多飲、消瘦等；模型組大鼠在4周時(shí)死亡1只，8周時(shí)死亡2只，12周時(shí)死亡3只。

2.2 24 h尿蛋白定量

對(duì)照組大鼠24 h尿蛋白量低于模型組（P＜0.05）；在第4周時(shí)，模型組大鼠的尿蛋白量開始明顯增多，在第12周時(shí)達(dá)到最大量。結(jié)果見表1。

2.3 光鏡觀察

對(duì)照組大鼠腎小球、腎小管、腎間質(zhì)無病理性改變，結(jié)果見圖1。在模型組大鼠中，從第4周開始就可以發(fā)現(xiàn)足突變形，結(jié)果見圖2；在第8周時(shí)可見足突融合，結(jié)果見圖3；在第12周時(shí)可見部分腎小球體積增大，并伴有系膜細(xì)胞、基質(zhì)增生，足細(xì)胞足突融合略有加重，部分上皮細(xì)胞空泡變性，腎小管擴(kuò)張，間質(zhì)區(qū)可見淋巴細(xì)胞等，結(jié)果見圖4。

2.4 免疫組化結(jié)果

在腎小管、腎間質(zhì)中幾乎無WT1的表達(dá)，WT1表達(dá)在腎小球中且位于足細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，染色呈灰棕色；其染色程度隨著尿蛋白量的增多逐漸深染；在第12周時(shí)，足細(xì)胞的細(xì)胞核被染成咖啡色。結(jié)果見圖 5、6。

2.5 Western blot結(jié)果

模型組的WT1表達(dá)量從第1周開始逐漸增加，但第1、2周模型組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），從第4周開始，各模型組大鼠WT1表達(dá)量與對(duì)照組相比均增多，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。 見圖7和表2。

2.6 24 h尿蛋白量與WT1的相關(guān)性結(jié)果

各模型組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的WT1表達(dá)量與24 h尿蛋白量之間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.723 52，P ＜ 0.01）。

3 討論

圖1 對(duì)照組（HE染色，400×）

圖2 模型4周組（HE染色，400×）

圖3 模型8周組（HE染色，400×）

圖4 模型12周組（HE染色，400×）

圖5 對(duì)照組（12周，400×，免疫組化）

圖6 模型組（12周，400×，免疫組化）

表2 對(duì)照組與各模型組大鼠WT1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 對(duì)照組與各模型組大鼠WT1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

對(duì)照組模型1周組模型2周組模型4周組模型8周組模型12周組666666 0.19±0.12 0.43±0.41*0.56±0.36*1.04±0.45*1.51±0.79*2.02±1.06*組別 只數(shù) WT1吸光度/β-actin吸光度

糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝性疾病，它較少直接導(dǎo)致死亡，其真正致死、致殘的原因是其嚴(yán)重的并發(fā)癥，DN即屬于糖尿病三大并發(fā)癥之一，是糖尿病全身性微血管病變之一[1]。DN患者的微血管發(fā)生病變，出現(xiàn)糖尿病性腎小球硬化癥。DN早期腎體積增大，腎小球?yàn)V過率增加，呈高濾過狀態(tài)，以后逐漸出現(xiàn)間隙蛋白尿或微量白蛋白尿，隨著病程的延長，出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫、高血壓、腎小球?yàn)V過率降低，進(jìn)而出現(xiàn)腎功能不全、尿毒癥[2]。因此，若能早期診斷DN，并采取有效的預(yù)防性治療，對(duì)阻止糖尿病腎病的發(fā)展有重要意義[3]。對(duì)已有明顯腎病的患者應(yīng)盡可能減慢腎小球?yàn)V過率的下降和SCr上升的速度，以減慢腎臟損害的速度[4]。

蛋白尿不僅是DN早期的主要臨床表現(xiàn)，而且是促進(jìn)DN進(jìn)展的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在蛋白尿的發(fā)生中腎小球臟層上皮細(xì)胞即足細(xì)胞的改變起重要作用。足細(xì)胞分子和電荷屏障損傷在DN起始和蛋白尿、腎小球硬化發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。近年發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞上的蛋白對(duì)于維持足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和腎小球?yàn)V過屏障的功能起著重要作用[6]。WT1是一個(gè)腫瘤抑制基因，對(duì)泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育有重要的意義[7]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)WT1與許多腎小球疾病的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)。腎臟形成后，其表達(dá)僅限于足細(xì)胞中，對(duì)維持正常的足細(xì)胞功能起著非常重要的作用[8]。Denys-Drash綜合征（以腎小球迅速發(fā)展為終末期腎病、男性假兩性畸形、Wilms′腫瘤三聯(lián)征為特征）是由WT1突變引起的疾病，其腎臟功能損害程度與廣泛的腎小球硬化和嚴(yán)重的足突細(xì)胞變異有關(guān)[9]。Guo等[10]證明，WT1表達(dá)水平的減少，將導(dǎo)致腎小球腎炎，其嚴(yán)重性依賴基因量的多少。也有報(bào)道稱[11]，足細(xì)胞內(nèi)WT1表達(dá)的減少或缺失與突變蛋白的結(jié)合能力下降程度相符。

本實(shí)驗(yàn)觀察了WT1蛋白在DN大鼠模型中的表達(dá)，驗(yàn)證了WT1蛋白存在于細(xì)胞核中，與文獻(xiàn)提到的相符。 在模型組的第 1、2、4、8、12 周，隨著 DN 大鼠尿蛋白量的不斷增多，腎小球系膜硬化逐步加重，足突部分融合，WT1蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)進(jìn)行性上升的趨勢。這一現(xiàn)象與Guo等[10]證明，WT1蛋白表達(dá)水平的減少，將導(dǎo)致腎小球腎炎，其嚴(yán)重性依賴基因量的多少的現(xiàn)象似乎是不一致的。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠WT1蛋白的表達(dá)量從第1周開始增加至第12周，從而可以推斷足細(xì)胞的變異性改變激發(fā)WT1蛋白代償性的增加，隨尿蛋白量的增加WT1蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)出增多的趨勢，但是這種趨勢可能是破壞了WT1蛋白原有的增殖體系，破壞了其他維系足細(xì)胞分子平衡的機(jī)制，因而導(dǎo)致足突的病理改變加重，其功能也隨之降低，導(dǎo)致尿蛋白量也隨之增多。但在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠的初、末時(shí)間觀察點(diǎn)分別在第1周及第12周末，而在此兩個(gè)觀察點(diǎn)前后的時(shí)間段，WTI蛋白的變化并沒有用實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步去探究，所以其變化仍不明確；雖然WT1蛋白的表達(dá)量與24 h尿蛋白量之間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系，但是，其相關(guān)性僅為72.352%，所以以WT1蛋白來評(píng)估早期足細(xì)胞損害的程度還有欠缺之處，仍然需要探究證實(shí)。

DN治療的關(guān)鍵在于早期診斷及治療，DN的早期表現(xiàn)主要是尿微量白蛋白（U-mAlb）的升高，對(duì)早期DN U-mAlb的治療可明顯延緩DN進(jìn)入終末期腎病的時(shí)間，DN一旦進(jìn)展成臨床蛋白尿期，腎損害是難以可逆的，有效控制早期DN的進(jìn)展是目前DM臨床的重要課題[12]，所以WT1蛋白在提示足細(xì)胞早期損傷方面有著重要意義，但其與足細(xì)胞損害程度導(dǎo)致蛋白尿產(chǎn)生的相關(guān)性還有局限，需待進(jìn)一步去探索證實(shí)。

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