李 陽(yáng) 孫世光 謝予朋 孫曉迪 閆 薈 石亞飛

1.北京軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，北京 100700；2.河北北方學(xué)院研究生部，河北張家口 075000

徐長(zhǎng)卿為蘿藦科多年生草本植物，《太平圣惠方》記載，徐長(zhǎng)卿具有化瘀散結(jié)，降脂通絡(luò)等作用[1]。臨床上用于調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂，降低血脂、防治心腦血管動(dòng)脈硬化[2]。攻膜復(fù)合物C5b-9的過(guò)度活化引發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的主要原因[3]，前期實(shí)驗(yàn)研究已確定了導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的C5b-9臨界濃度，即C5b-9的亞溶破劑量，本文旨在研究徐長(zhǎng)卿提取物對(duì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥介質(zhì)活性的調(diào)節(jié)作用，探究徐長(zhǎng)卿治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVEC（上海青忠貿(mào)易有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司），RPMI1640 培養(yǎng)基（Hyclone公司），補(bǔ)體 C5b-6、C8、C9（德國(guó) Merck 公司），補(bǔ)體 C7（美國(guó) Sigma公司），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白細(xì)胞介素-8（IL-8）試劑盒（南京建成），徐長(zhǎng)卿藥材（購(gòu)自吉林大藥房），丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品（北京藥品生物制品檢定所），標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 徐長(zhǎng)卿藥材有效成分提取 稱取徐長(zhǎng)卿藥材適量，置于圓底燒瓶中，加入適量50%乙醇溶液，回流提取2 h，待提取液冷卻后二次回流提取1 h，放冷過(guò)濾，經(jīng)冷凍干燥后，得到藥材凍干粉。

1.2.2 內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的建立[4-7]前期應(yīng)用激光共聚焦顯微技術(shù)已確定了導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的C5b-9的臨界濃度，現(xiàn)將該濃度的C5b-9組裝于內(nèi)皮細(xì)胞表面，具體過(guò)程如下：用2.5 mg/L的胰蛋白酶消化分離細(xì)胞，預(yù)熱無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，1000 r/min，離心 5 min。 加入純品 C5b-6（1.6 mg/L，1 mL）和 C7（10 mg/L，1 mL），置于 37℃孵育 1 h。RPMI 1640洗去未結(jié)合的補(bǔ)體成分，加入 C8（10 mg/L，1 mL）和C9（10 mg/L，1 mL），置于 37℃孵育 1.5 h。 RPMI 1640洗去未結(jié)合的補(bǔ)體，將組裝好的細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔接種 1.5×104細(xì)胞），置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h，使細(xì)胞穩(wěn)定。

1.2.3 提取物對(duì)損傷細(xì)胞的作用 分別稱取適量藥材提取物凍干粉及丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品，用PBS緩沖溶液配制成高、中、低濃度溶液，分別用以上藥物處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照及模型對(duì)照組。處理后細(xì)胞置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育96 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

1.2.4 測(cè)定上清液中各炎癥介質(zhì)的活性 按照試劑盒說(shuō)明書，分別測(cè)定收集的上清液中LDH、TNF-α及IL-8的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)上清液中各炎癥介質(zhì)的分泌水平見表1。由表1可知，徐長(zhǎng)卿提取物高劑量組及中劑量組與模型對(duì)照組比較，LDH、TNF-α及IL-8分泌水平差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但高劑量組中各炎癥介質(zhì)的分泌水平與空白對(duì)照組水平接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組結(jié)果基本一致，其中中劑量組對(duì)LDH的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于高劑量組。

3 討論

早期研究已經(jīng)證實(shí)，徐長(zhǎng)卿藥材中的主要成分為丹皮酚，占藥材總量的1%左右[8-9]。前期實(shí)驗(yàn)研究得出50%乙醇提取可最大限度得到有效成分。趙霞等[10]通過(guò)研究丹皮酚對(duì)高脂血癥大鼠的膽固醇、三酰甘油等血象指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用，得知丹皮酚可調(diào)節(jié)主動(dòng)脈組織中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生，改善炎癥細(xì)胞因子的分泌；有研究指出，丹皮酚能夠抑制細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生[11]，這可能對(duì)炎癥環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響；戴敏等[12]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可降低動(dòng)脈粥樣硬化家兔血清中TNF-α含量，抑制兔血管平滑肌細(xì)胞的增殖；周曉慧等[13]指出，丹皮酚可抑制NF-κB信號(hào)通路，從而介導(dǎo)黏性分子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)以人體血管組織細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)載體，建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，藥物干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn)，徐長(zhǎng)卿藥材提取物可顯著降低炎癥因子LDH、TNF-α及IL-8的活性，進(jìn)而修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，以達(dá)到治療動(dòng)脈粥樣硬化的目的。實(shí)驗(yàn)中設(shè)立丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照組，得出了與實(shí)驗(yàn)組一致的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了發(fā)揮主要治療作用的有效成分即為丹皮酚。

表1 各組上清液中各炎癥介質(zhì)分泌水平（±s）

表1 各組上清液中各炎癥介質(zhì)分泌水平（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；與模型對(duì)照組比較，**P ＜0.01；LDH：乳酸脫氫酶；TNF-α：腫瘤壞死因子；IL-8：白細(xì)胞介素-8；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

空白對(duì)照組模型對(duì)照組提取物高劑量組中劑量組低劑量組丹皮酚高劑量組中劑量組低劑量組--1.60 0.80 0.40 0.20 0.10 0.05 117.85±1.65 200.49±3.31△△119.85±4.12**165.20±3.51△△**222.78±5.55△△123.53±4.80△**118.58±4.99**161.32±4.81△△**96.00±2.26 108.00±2.30△△94.75±3.19**92.81±1.78△**132.69±1.84△△98.42±0.90**105.56±2.15△△116.12±2.89△△30.88±2.50 40.98±0.60△△33.65±2.48**37.28±0.26△△**43.55±0.64△△31.52±1.20**37.12±1.37△△**37.95±0.97△△**組別 給藥劑量（g/L） LDH（U/L） TNF-α（ng/L） IL-8（ng/L）

內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生后，可產(chǎn)生多種炎癥因子，常見的有LDH、TNF-α、IL-8等，這些炎癥因子可導(dǎo)致血管功能紊亂，阻斷局部血流供應(yīng)，使組織缺血缺氧壞死，進(jìn)而加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度[14-16]。徐長(zhǎng)卿中的主要有效成分丹皮酚可能干預(yù)這些炎癥因子的受體表達(dá)，以降低其活性，因此今后可從分子水平對(duì)該類基因的表達(dá)進(jìn)行更深層次的研究。

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