方 向，鮑遠(yuǎn)程，金珊，陳懷珍

肝豆?fàn)詈俗冃裕╓D）是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙疾病[1]，除常見神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟損害癥狀外，研究發(fā)現(xiàn) WD患者的一些高級神經(jīng)活動(dòng)記憶和智能等都受到影響，其中腦型WD患者存在有嚴(yán)重的記憶障礙，平均記憶商64，有輕度智能障礙，平均總智商為83.87、言語智商為92.60、操作智商為78.73，而無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的WD患者也存在輕微記憶障礙，記憶商平均為91.75。提示銅（Cu）損害造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷對WD患者的學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生了一定的影響[2]。本實(shí)驗(yàn)通過Morris水迷宮試驗(yàn)，觀察銅對大鼠學(xué)習(xí)記憶行為和海馬區(qū)ERK陽性細(xì)胞表達(dá)的影響，為WD的基礎(chǔ)研究及WD患者學(xué)習(xí)記憶功能障礙的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 清潔級健康3個(gè)月齡Wistar大鼠40只（安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），均為雄性，體重180g～200g（合格證號：SCXR－2011－002）。Morris水迷宮，北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司；去離子水由安徽大東方藥業(yè)提供；硫酸銅、硝酸為優(yōu)級純，由合肥大藥房提供；原子吸收分光光度計(jì)為北京WFX－1A型；721型分光光度計(jì)由上海第三分析儀器廠生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成正常對照組、模型組，每組20只，動(dòng)物于專用實(shí)驗(yàn)室中分籠飼養(yǎng)，室溫保持在22℃～25℃，自然晝夜循環(huán)非直射光照下生活，自由飲水。

1.3 動(dòng)物處理 對照組繼續(xù)喂食標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料，模型組喂飼含硫酸銅1g／kg的粉狀飼料和0.185%硫酸銅的去離子水8周（銅負(fù)荷飲食）。

1.4 行為學(xué)檢測 銅負(fù)荷飲食8周后開始行為學(xué)檢測，包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)，共進(jìn)行6d。定位航行試驗(yàn)：每天2次，歷時(shí)5d。開始時(shí)將平臺置于水池第三象限，跟蹤記錄大鼠游泳軌跡，將大鼠面向池壁，記錄在2min內(nèi)尋找到平臺的時(shí)間（逃避潛伏期）?？臻g探索試驗(yàn)：定位航行試驗(yàn)完成后撤去平臺，將大鼠由任一入水點(diǎn)面向池壁放入水中，測定在2min內(nèi)跨越平臺次數(shù)。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 行為學(xué)檢測結(jié)束后每組隨機(jī)選取10只大鼠于代謝籠中連續(xù)留取3天（72h尿液），搖勻后準(zhǔn)確量出尿液體積，加H2SO4混勻，采用原子吸收法測定尿銅含量。

尿銅標(biāo)本留取后，大鼠在2%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉下，分別留取肝、腦組織標(biāo)本組織標(biāo)本先用0.9%NaCl反復(fù)洗凈，再用干凈濾紙吸干并秤取濕重，采用濕式消化法消化定容，用原子吸收法測肝、腦組織銅元素含量。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠組織Cu、24h尿銅水平比較 模型組與對照組比較肝、腦組織的Cu含量及24h尿銅水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表1。

表1 大鼠肝、腦組織的Cu含量及24h尿銅水平變化（±s）

表1 大鼠肝、腦組織的Cu含量及24h尿銅水平變化（±s）

組別 n 肝組織銅μg／g腦組織銅μg／g 24h尿銅mg／24h對照組 10 4.11±0.69 2.02±0.17 2.12±0.57模型組 10 25.37±0.31 3.61±0.12 3.55±0.17 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 空間探索學(xué)習(xí)記憶能力 在定位航行試驗(yàn)中，為隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組大鼠的平均逃避潛伏期總體呈逐漸下降趨勢，表明各組大鼠均有通過訓(xùn)練，對水下平臺的空間定位獲得認(rèn)知并產(chǎn)生記憶的能力。模型組和對照組比較，逃避潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

在空間探索試驗(yàn)中，對照組大鼠大多采取直線方式搜索平臺，而銅負(fù)荷模型組沿池壁搜索時(shí)間較長，2min內(nèi)銅負(fù)荷組跨越平臺次數(shù)明顯少于對照組（P＜0.01）。詳見表2。

表2 大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)比較（±s）

表2 大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)比較（±s）

組別 n 逃避潛伏期（s） 穿越次數(shù)（次）對照組 20 21.07±11.05 3.6±2.1模型組 20 35.63±12.07 1.2±1.1 P＜0.01 ＜0.01

3 討 論

銅是人體必需的微量元素，而銅代謝障礙疾病WD引起過量的銅在各器官組織中沉積，則可以引起各器官功能的嚴(yán)重?fù)p害。學(xué)習(xí)和記憶是腦的高級神經(jīng)活動(dòng)之一，WD造成的銅沉積可以造成神經(jīng)系統(tǒng)變性引起整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)受累[3]，除常見的錐體外系癥狀外，WD患者還可以出現(xiàn)包括學(xué)習(xí)成績、記憶力、注意力等在內(nèi)的神經(jīng)、心理功能損害的表現(xiàn)。銅是許多功能蛋白如過氧化物歧化酶、酪氨酸環(huán)化酶等必需的微量元素，當(dāng)銅代謝失衡時(shí)可以通過對功能分子構(gòu)象的直接損害和／或造成活性氧族、活性氮族的生成而造成持續(xù)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體損傷而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)退行性變，影響了突觸傳導(dǎo)功能，引起神經(jīng)行為的改變[4]。而銅沉積在肝組織中導(dǎo)致的隱匿性肝性腦病和／或代謝異常也可能影響患者的腦功能。

目前沒有任何一種動(dòng)物模型可以復(fù)制WD的所有臨床特征[5]，本實(shí)驗(yàn)WD模型組大鼠肝、腦組織中銅水平顯著高于對照組，可以確定的是銅負(fù)荷飲食可以使大鼠在肝、腦等組織中產(chǎn)生類似WD銅沉積過程[6]。Morris水迷宮作為評價(jià)嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶的試驗(yàn)方法被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)研究[7]。本研究中通過研究Morris水迷宮中銅負(fù)荷大鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數(shù)來反映其空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化，結(jié)果表明銅負(fù)荷飲食喂養(yǎng)8周后，模型組大鼠與對照組大鼠比較，逃避潛伏期和跨越平臺次數(shù)均存在顯著差異，反映出銅負(fù)荷模型大鼠在水迷宮試驗(yàn)中學(xué)習(xí)定位能力顯著下降，存在著明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。提示銅負(fù)荷模型法在一定程度上適用于WD神經(jīng)心理損害的發(fā)病機(jī)制和藥物療效評價(jià)研究。

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