李小會， 趙明君， 雷根平， 蘇衍進

(1.陜西中醫(yī)學院，陜西咸陽712046;2.陜西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院，陜西咸陽712046)

糖尿病腎病 (diabetic nephropathy)是糖尿病最常見、最嚴重的微血管并發(fā)癥，是糖尿病心、腦、腎三大嚴重并發(fā)癥之一。在歐美發(fā)達國家，糖尿病已成為終末期腎病的主要原因，慢性腎功能衰竭透析病人中糖尿病腎病占43%左右，并已成為糖尿病的主要死亡原因之一［1］，在我國糖尿病的患病率快速上升，糖尿病腎病在終末期腎病中占15%。根據(jù)糖尿病腎病的病機特點［2］——消渴日久，腎虧陰陽兩傷;同時“腎絡瘀阻”貫穿糖尿病腎病病程始終，更是產(chǎn)生并發(fā)癥的病理基礎，抓住“腎虛”與“腎絡瘀阻”的主要病機，采用通絡益腎法以經(jīng)方腎氣丸合抵當湯化裁組成通絡益腎方，前期的臨床和實驗研究均證實該方能改善糖尿病腎病患者及大鼠的血糖、血脂、腎功能［3-5］。本實驗通過進一步的實驗研究，觀察高糖下大鼠腎小球系膜細胞 (glomerularmesangial cell)增殖、細胞外基質 (extracellularmatrix)調控系統(tǒng)基質金屬蛋白酶-9/金屬蛋白酶組織抑制物-1(Matrix metalloproteinase-9/Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，MMP-9/TIMP-1)和轉化 生 長 因 子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達及該方的干預效果，從細胞水平探討其腎保護機制。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1，購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。通絡益腎方(桃仁12 g、生地30 g、山萸肉15 g、山藥15 g、酒大黃10 g、水蛭3 g、黃芪30 g、淫羊藿10 g、葛根12 g、澤瀉12 g、茯苓12 g、牛膝12 g，水煎，每日一劑)。藥物經(jīng)過常規(guī)煎煮、過濾、水浴蒸發(fā)至每毫升含生藥材2.23 g，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。鹽酸貝那普利 (洛汀新)，規(guī)格10 mg/片，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn);糖適平規(guī)格為30 mg/片，北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)。

四甲基偶氮唑鹽 (MTT)購自Sigma公司，二甲基亞砜 (DMSO)、胰蛋白酶購自CIBCO公司，MMP-9 ELISA試劑盒、TIMP-1 ELISA試劑盒購自美國RB公司。

1.2 方法

1.2.1 制備含藥血清 健康雄性SD大鼠35只，體質量 (180±20)g，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組，即空白對照組、西藥對照組、通絡益腎方大、中、小劑量組，每組7只。通絡益腎方大、中、小劑量組各按13.4 g/(kg·d)、6.7 g/(kg·d)、3.35 g/(kg·d)灌胃給相應中藥，西藥對照組按糖適平18 mg/(kg·d)加洛汀新5 mg/(kg·d)灌胃給藥，正常對照組給予等體積生理鹽水灌胃。每天1次，連續(xù)給藥7 d。于末次給藥2 h后，頸動脈取血，離心取血清，56℃水浴30 min滅活補體，除菌過濾后，分裝凍存。

1.2.2 實驗分組及藥物處理 參考文獻 ［6-7］，取對數(shù)增長期的3～5代大鼠腎小球系膜細胞，胰蛋白酶消化計數(shù)后接種于孔板中，待細胞完全貼壁，棄上清，加入不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基同步化24 h后，吸掉培養(yǎng)上清，分組加入藥物血清。實驗共分6組:高糖組只加入30 mmol/L葡萄糖;空白對照組加入30 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清;通絡益腎方中藥治療組 (設大、中、小三個劑量組)加入30mmol/L葡萄糖+通絡益腎方大、中、小劑量10%的含藥血清;西藥對照組加入30 mmol/L葡萄糖+洛汀新、糖適平10%的含藥血清。每組設12個復孔。置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后待檢。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法 (MTT法)檢測系膜細胞增殖 上述各實驗組細胞培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)板各孔中培養(yǎng)液，加入PBS 200 μL沖洗兩次，再加入180μL培養(yǎng)液以及MTT溶液，37℃孵育4 h終止培養(yǎng)，加入 DMSO 150μL，室溫避光震蕩10 min，于酶標儀檢測各孔570 nm處的吸光度值 (A570)。

1.2.4 培養(yǎng)上清液中 TGF-β1、MMP-9和TIMP-1的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)檢測細胞培養(yǎng)液上清 TGF-β1、MMP-9及 TIMP-1水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 (± s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較用方差分析，以P≤0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 通絡益腎方對高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響 與空白對照組比較，高糖組腎小球系膜細胞顯著增殖 (P＜0.01);與高糖組比較，通絡益腎方高、中、低各劑量組均能顯著抑制腎小球系膜細胞增殖 (P＜0.01或P＜0.05)，其中以高劑量組效果最佳，呈劑量依賴性;西藥對照組對腎小球系膜細胞增殖的抑制作用和通絡益腎方中劑量組相當 (P＞0.05)。見表1。

2.2 通絡益腎方對高糖誘導腎小球系膜細胞上清液中TGF-β1、MMP-9和 TIMP-1表達的影響 與空白對照組比較，高糖組大鼠腎小球系膜細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1和TIMP-1水平顯著增加，MMP-9水平呈著減少 (均P＜0.01);與高糖組比較，通絡益腎方大、中、小劑量組 TGF-β1和 TIMP-1水平均顯著減少，MMP-9表達升高 (P＜0.05或P＜0.01)，尤以高劑量組療效最佳，呈劑量依賴性;西藥對照組上述指標表達水平和通絡益腎方中劑量組相當，兩組比較P＞0.05。見表2。

表1 通絡益腎方對大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響( ± s)Tab.1 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomerular mesangial cell proliferation

表1 通絡益腎方對大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響( ± s)Tab.1 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomerular mesangial cell proliferation

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與高糖組比較，△P＜0.05，△△P ＜0.01;與西藥對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與通絡益腎方大劑量組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 動物數(shù)/只 OD值空白對照組12 0.61±0.33高糖組 12 0.89 ±0.41＊＊西藥對照組 12 0.72 ±0.49＊＊△通絡益腎方大劑量組 12 0.66±0.25△△#通絡益腎方中劑量組 12 0.73±0.38△△★通絡益腎方小劑量組 12 0.81±0.51△★★

表2 通絡益腎方對MC TGF-β1、MMP-9和TIMP-1表達的影響 ( ± s，μg/L)Tab.2 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomeru lar mesangial cell，TGF-β1，MMP-9 and TIMP-1

表2 通絡益腎方對MC TGF-β1、MMP-9和TIMP-1表達的影響 ( ± s，μg/L)Tab.2 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomeru lar mesangial cell，TGF-β1，MMP-9 and TIMP-1

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與高糖組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與西藥對照組比較，#P＜0.05;與通絡益腎方大劑量組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 動物數(shù)/只 TGF-β1MMP-9 TIMP-1 MMP-9/TIMP-1空白對照組 12 55.91±8.37 38.54±6.80 18.45±2.70 1.57±0.18高糖組 12 88.49±9.32＊＊ 18.75±5.65＊＊ 29.74±3.78＊＊ 0.64±0.04＊＊西藥對照組 12 74.76±6.93＊＊ 28.26±4.40△＊＊ 21.68±3.74△＊ 1.18±0.07△＊通絡益腎方大劑量組 12 60.34±7.28△△# 35.59±4.67△△# 18.75±0.91△△# 1.51±0.15△△#通絡益腎方中劑量組 12 71.89±6.85★△△ 29.77±5.63△△★ 22.71±2.92△★ 1.25±0.11△★通絡益腎方小劑量組 12 80.76±9.15★★△ 24.48±4.75△★★ 25.47±2.62△#★ 0.87±0.09△#★★

3 討論

糖尿病腎病的主要病理變化為腎小球基底膜增厚、細胞外基質增多和腎小球結節(jié)性或球性硬化。其中細胞外基質合成/降解失衡以及由此導致的細胞外基質過度積聚是導致腎小球硬化的直接原因。細胞外基質堆積是腎小球纖維化的基礎，是糖尿病腎病發(fā)展成終末期腎病的核心問題［8］。既往有關糖尿病腎病中細胞外基質變化的研究多關注于其合成增多的過程，而晚近研究顯示細胞外基質降解能力下降在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中起著更為重要的作用，并已成為研究的熱點?；|金屬蛋白酶系統(tǒng) (matrix metal loproteinases，MMPs)是調控腎臟細胞外基質代謝的重要降解酶系統(tǒng)，能降解除多糖以外的所有細胞外基質成分［9］。其中MMP-9主要由腎小球系膜細胞分泌，能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原，從而降解細胞外基質。TIMP-1是MMP-9的特異性抑制因子，能與活性MMP-9以1∶1比例結合形成不可逆復合物，阻斷MMP-9與底物結合，從而減少細胞外基質的降解。因此，MMP-1/TIMP-1在細胞外基質積聚和降解的生理平衡中起關鍵作用［8］。同時，在糖尿病腎病腎小球硬化的過程中，多種細胞因子形成網(wǎng)絡參與其中，而TGF-β1為這些復雜細胞因子網(wǎng)絡的中心因子［10］，在糖尿病腎病的發(fā)病中占有重要地位。實驗證實TGF-β1可促進腎小球系膜細胞過度增殖，作用呈劑量依賴性［11］。其通過促進腎小球系膜細胞過度增殖［12］;增加細胞外基質蛋白如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV型膠原、纖連蛋白，層連蛋白的合成，使其在腎小球沉積［13］;促進蛋白酶抑制因子 (纖溶酶原激活抑制因子PAI)、TIMP-1的合成，抑制MMP-9的生成與活化，最終導致細胞外基質的過度沉積［14］，因此其被認為是引起腎小球硬化的最關鍵的細胞因子。

通絡益腎方由抵當湯合腎氣丸化裁組成，方中生地黃、山萸肉滋陰補腎;水蛭、酒大黃、桃仁活血破血、逐瘀通經(jīng);山藥健脾補肺、益腎固精。此三藥補虛兼以破瘀，共為臣藥。黃芪補氣生陽、利水消腫;附子辛性溫補腎陽、補火暖土;澤瀉、茯苓利水滲濕泄?jié)?川牛膝補益肝腎、逐瘀通經(jīng)利水，兼具佐使之用。全方合用，消補兼施，活血通絡，滋陰助陽，與糖尿病腎病之腎虧陰陽兩虛，血瘀絡阻病機針對性符合，故而取得較好療效。本實驗研究結果顯示，高糖能明顯促進大鼠腎小球系膜細胞增殖，細胞上清液中TGF-β1和TIMP-1水平顯著增加，MMP-9水平減少，導致細胞外基質聚集;通絡益腎方低、中、高劑量組均能顯著抑制腎小球系膜細胞增殖，使TGF-β1和TIMP-1水平減少，MMP-9水平增加，以高劑量組作用最佳，呈劑量依賴性;西藥對照組對腎小球系膜細胞增殖的抑制作用和通絡益腎方中劑量組相當。提示通絡益腎方可能通過抑制腎小球系膜細胞增殖和下調TGF-β1、TIMP-1，升高MMP-9水平以促進細胞外基質的降解而發(fā)揮對糖尿病腎病的保護作用。

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