王泰然 劉閨男

1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院心內(nèi)科，河北邯鄲 056001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧沈陽(yáng) 110001

冠心病是臨床多發(fā)病癥，在現(xiàn)代社會(huì)當(dāng)中，冠心病患者也逐年增加，臨床治療冠心病的方法較多，但目前為止還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的治療方案，從冠心病患者的形成機(jī)制進(jìn)行研究，分析形成冠心病的主要因素，可以在很大程度上提高患者的臨床治療效果，達(dá)到臨床治療的目的。血小板源性生長(zhǎng)因子 （platelet derived growth factor，PDGF）是促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖的重要的生長(zhǎng)因子，尤其是血小板源性生長(zhǎng)因子-BB（PDGF-BB）刺激VSMC的作用更強(qiáng)烈[1-2]。文獻(xiàn)證實(shí)，抑制其活性可以很好地起到抑制RS的作用[1-2]。本次研究主要通過(guò)大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后的PDGF-BB分析，觀察生長(zhǎng)因子-1誘騙寡核苷酸對(duì)其影響，進(jìn)而分析臨床治療的可行性，詳細(xì)研究?jī)?nèi)容如下：

1 材料與方法

1.1 材料

研究選用北京醫(yī)科大學(xué)提供的健康雄性Wistar大白鼠96只，美國(guó)Baxter health corporation生產(chǎn)的2F Fogarty導(dǎo)管，Egr-1 decoy ODN、Egr-1 雜碼寡核苷酸 （scrambled decoy ODN，decoy ODN SCR）、Santa Cruz公司出產(chǎn)的 Egr-1兔抗大鼠多克隆抗體，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、武漢博士的公司出產(chǎn)的PDGF-BB兔抗大鼠多克隆抗體，大連寶生物公司出產(chǎn)的PCR引物合成，瑞士Roche公司生產(chǎn)的FuGENE6試劑。

1.2 方法

首先采用10%水合氯醛對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行麻醉，之后取大鼠頸部中間入路，將大鼠的左頸部動(dòng)脈進(jìn)行鈍性分離，使用血管夾進(jìn)行左頸動(dòng)脈暫時(shí)性的阻斷，采用2F導(dǎo)管插入大鼠左頸動(dòng)脈，注入0.2 mL的0.9%氯化鈉，最后反復(fù)抽拉大鼠的左頸動(dòng)脈，制作大鼠左頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型[3]。

將96只大鼠按照隨機(jī)原則分為4組，每組大鼠24只，在分組之后，標(biāo)注組別，并根據(jù)組別進(jìn)行不同的手術(shù)及研究。其中第一組為假手術(shù)組，采用分離左頸動(dòng)脈，之后不進(jìn)行球囊拉傷；第二組為損傷組，在大鼠球囊拉傷之后注入200 μL的1 mmol/L MgCl2液；第三組為SCR組，拉傷大鼠的左頸總動(dòng)脈后注入 200 μL 含有 500 μg SCR ODN、30 μL轉(zhuǎn)染試劑FuGene6的1 mmol/L MgCl2液；第四組為治療組，在大鼠左總動(dòng)脈球囊拉傷之后，局部注入200 μL含有500 μg FITC 標(biāo)記的 decoy ODN、30 μL 轉(zhuǎn)染試劑 FuGene6的1 mmol/L MgCl2溶液。不同組別大鼠處理完成之后，分別進(jìn)行觀察研究，研究期間將每組24只大鼠分為4個(gè)小組，每個(gè)小組6只大鼠，進(jìn)行觀察研究。

設(shè)計(jì)合成Egr-1特異誘騙寡核苷酸和Egr-1雜碼寡核苷酸Egr-1特異誘騙寡核苷酸基因序列為：上游5＇-TCGCCCTCGCCCCCGCTAAGGG-3＇，下游 3＇-AGCGGGGGC GGGGGCGATTCCC-5＇。并合成 Egr-1 decoy ODN SCR，即與誘騙序列類似的亂序排列寡核苷酸，其基因序列為：上游 5-AGCCGCACCGGCCTGCCTCGTC-3＇， 下游 3＇-TCGGCGTGGCCGGACGGA-GCAG-5＇。在其3'端和 5'端進(jìn)行硫代修飾，部分誘騙寡核苷酸5'端用異硫氰酸熒光素（fluoresceine isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記用于觀察轉(zhuǎn)染效率。

在體decoy ODN轉(zhuǎn)染室溫下將Egr-1 decoy ODN 500 μg和轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6 30 μL充分混合成復(fù)合物，將復(fù)合物溶入170 μL的1 mmol/L MgCl2液當(dāng)中，保持在大鼠血管球囊損傷模型制作的同時(shí)，可以進(jìn)行大鼠頸部外的動(dòng)脈注射。使用熒光顯微鏡觀察大鼠的轉(zhuǎn)染情況，當(dāng)大鼠轉(zhuǎn)染治療1 d后，殺死1只大鼠，并提取該大鼠的治療部分的血管，將切下的血管保存在液氮當(dāng)中，制作冰凍切片，最后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，判斷大鼠轉(zhuǎn)染的成功與否，若經(jīng)波長(zhǎng)460 nm激發(fā)后殘存血管內(nèi)膜及中膜發(fā)出綠色熒光，則為轉(zhuǎn)染成功。

保持無(wú)菌的情況下，于手術(shù)的不同時(shí)間內(nèi)制作大鼠的標(biāo)準(zhǔn)，將大鼠進(jìn)行麻醉并分離大鼠的左頸部的總動(dòng)脈，切下大鼠的球囊，使用肝素鹽水沖洗大鼠的血管，將一半大鼠的球囊進(jìn)行中性甲醛固定病理學(xué)檢查，另一半球囊在-70℃中保存，提供RNA提取及組織蛋白的檢測(cè)等。

將大鼠的球囊病理檢測(cè)標(biāo)本使用石蠟進(jìn)行包裹，并在其橫截面上隨機(jī)切下3張5 μm厚的切片，通過(guò)HE染色之后在光鏡顯微鏡下觀察其血管內(nèi)膜增生的發(fā)展及發(fā)生情況，最后采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析，統(tǒng)計(jì)每隔3張切片內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算大鼠內(nèi)膜增生的面積、中膜、管腔面積及內(nèi)膜與中膜的面積比等數(shù)據(jù)。

Egr-1和PDGF-BB mRNA的檢測(cè)采用Trizol一步法提取血管組織總RNA，取各組總RNA 3 μL逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。以2 μg cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為20 μL，包 括 2 μL 的 c DNA，10 μL 的 S YBRPremix Ex TaqTM，0.4 μL的引物和7.2 μL的超純水。Egr-1上游引物5'-CCCAAACTGGAGGAGATGA-3'，下游引物 5 'GAGGCAGAGGAAGACGATG-3'。PDGF-BB上游引物5'-CCAGGACGGTCATTTACG-3'，下游引物 5 '-TGGTCTGGGTTCAGGTTG-3'。β-actin 上游引物 5 '-CGTGCGTGACATTAAAGAG-3'，下游引物5'-TTGCC-GATAGTGATGACCT-3'。β-actin作為每個(gè)樣品的內(nèi)參。使用美國(guó)的ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀，反應(yīng)條件為：1 個(gè)循環(huán)的預(yù)變性（95°C 30 s），40 個(gè)循環(huán)的退火（95°C 5 s）和延伸（60°C 34 s）。目的基因相對(duì)于對(duì)照基因的表達(dá)量用2－△△Ct[3]法算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Egr-1和PDGF-BB蛋白的表達(dá)：每?jī)蓚€(gè)血管樣本為一組，剪碎后提取各組動(dòng)脈總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，并進(jìn)行蛋白變性、配膠、電泳、轉(zhuǎn)印、封閉、一抗孵育，之后再加入稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，洗膜液洗3次，每次10 min，顯色2～5 min，待蛋白條帶顯示清晰時(shí)，中止反應(yīng)，掃描，凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶的平均積分光密度值，記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究中所有數(shù)據(jù)統(tǒng)一使用SPSS 18.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在體轉(zhuǎn)染效果觀察

本次研究當(dāng)中大鼠轉(zhuǎn)染均較為成功，通過(guò)熒光顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)殘存血管當(dāng)中的內(nèi)膜及中膜出現(xiàn)大量的綠色熒光分布，詳細(xì)情況見(jiàn)圖1。

圖1 Egr-1 decoy ODNs的在體轉(zhuǎn)染

2.2 血管病理形態(tài)學(xué)觀察

假手術(shù)組當(dāng)中大鼠為假手術(shù)處理，結(jié)果大鼠的總動(dòng)脈內(nèi)膜非常完整，手術(shù)完成后，損傷組和SCR組大鼠的內(nèi)皮出現(xiàn)剝落，且沒(méi)有發(fā)生內(nèi)膜增生。手術(shù)完成1周后，損傷組和SCR組大鼠發(fā)生血管內(nèi)的內(nèi)膜增生，發(fā)生管腔狹窄情況，其中2、3周后，大鼠的血管內(nèi)膜增生更加明顯，通過(guò)檢查，發(fā)生血管內(nèi)膜增生當(dāng)中具有非常多的平滑肌細(xì)胞和膠原纖維，且排列非常紊亂，形態(tài)差異較大，血管管腔顯著狹窄。損傷組、SCR組與治療組相比，大鼠的內(nèi)膜增生差異明顯，治療組大鼠的內(nèi)膜增生受到了較強(qiáng)的抑制，沒(méi)有明顯內(nèi)膜增生情況發(fā)生。見(jiàn)圖2。

圖2 Egr-1 decoy ODNs對(duì)球囊損傷后新生內(nèi)膜增生的影響（HE染色）

2.3 血管壁Egr-1和PDGF-BB mRNA表達(dá)結(jié)果

假手術(shù)組的大鼠檢測(cè)結(jié)果均為微弱表達(dá)情況，大鼠的球囊在損傷之后，血管壁的兩種表達(dá)結(jié)果都出現(xiàn)增加的情況，且Egr-1的增加情況非常明顯，處于持續(xù)增加的狀況當(dāng)中，而在第21天的檢測(cè)時(shí)，損傷組及SCR組的檢查結(jié)果為假手術(shù)組的（20.12±2.13）倍和（18.38±1.87）倍。而 PDGFBB mRNA的高峰在14 d，在SCR組和對(duì)照組的表達(dá)分別是假手術(shù)組的（19.03±1.55）倍和（18.39±1.62）倍，治療組大鼠通過(guò)治療之后，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的血管壁檢查結(jié)果都顯示其表達(dá)減少，明顯低于損傷組、SCR組大鼠的檢查結(jié)果（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組Egr-1和PDGF-BB mRNA的表達(dá)

2.4 大鼠Western blot檢測(cè)Egr-1和PDGF-BB的蛋白合成檢查結(jié)果

假手術(shù)組大鼠的兩種檢查結(jié)果都處于微弱表達(dá)情況，大鼠的球囊損傷后與血管壁檢測(cè)的表達(dá)結(jié)果較為相似，同樣為Egr-1的表達(dá)隨著時(shí)間持續(xù)增強(qiáng)；而PDGF-BB的最高表達(dá)在14 d，之后開(kāi)始下降，治療組大鼠完成治療后，蛋白表達(dá)情況明顯減弱，與損傷組、SCR組大鼠的情況相比較為明顯。見(jiàn)圖4。

3 討論

圖4 Western blot法檢測(cè)各組血管組織Egr-1和PDGF-BB的表達(dá)

冠心病病癥的治療，采用手術(shù)方法可以有效提高患者的治療效果[4-5]，然而臨床也發(fā)現(xiàn)，患者在手術(shù)治療完成后，容易發(fā)生再狹窄并發(fā)癥，對(duì)患者的身體健康和恢復(fù)情況造成較大的影響，且會(huì)導(dǎo)致患者遠(yuǎn)期療效降低的情況[6-8]。通過(guò)對(duì)不同因素及形成機(jī)制進(jìn)行研究，深入到再狹窄患者的基因研究當(dāng)中，可以從一定程度上觀察到患者的內(nèi)皮細(xì)胞，并對(duì)其出現(xiàn)的分裂、增生、內(nèi)膜增生等表達(dá)情況進(jìn)行分析，可以在很大程度上提高冠心病患者術(shù)后并發(fā)癥的防治工作[9-14]。通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)資料研究，有研究利用Egr-1的特異脫氧核酶抑制了動(dòng)脈損傷后Egr-1表達(dá)及新生內(nèi)膜的增生，在研究中發(fā)現(xiàn)，Egr-1在VSMC的增殖中具有非常明顯的調(diào)控作用，通過(guò)干預(yù)Egr-1轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)，可以有效的防止VSMC增殖，進(jìn)而降低內(nèi)膜增生的發(fā)生概率，也就是在一定程度上降低了冠心病患者術(shù)后再狹窄并發(fā)癥的出現(xiàn)概率，效果也較為明顯[15]。

在臨床免疫檢驗(yàn)分析當(dāng)中，冠心病術(shù)后并發(fā)癥同樣也被證實(shí)是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染而發(fā)生的，且這種轉(zhuǎn)染的競(jìng)爭(zhēng)性、活化性非常強(qiáng)，可以快速完成識(shí)別結(jié)構(gòu)，同理，在研究治療過(guò)程中，從這個(gè)角度出發(fā)，抑制下游基因表達(dá)，那么就可以有效降低患者的并發(fā)癥發(fā)生情況，降低術(shù)后再狹窄的出現(xiàn)概率。根據(jù)文獻(xiàn)研究，使用decoy ODN調(diào)控基因表達(dá)的基因治療策略，同樣是通過(guò)大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷研究，結(jié)果大鼠在球囊損傷后2個(gè)星期內(nèi)的新生內(nèi)膜得到了有效的抑制[16-17]，證實(shí)這種基因表達(dá)改變可以有效地抑制內(nèi)膜增生，效果非常明顯。同時(shí)，有研究利用NF-κB decoy ODN轉(zhuǎn)染球囊損傷后鼠頸動(dòng)脈亦顯著減輕了新生內(nèi)膜的生成[18]。研究表明Egr-1 Decoy ODNs抑制VSMC增殖，此作用與其抑制PCNA、cyclin D1、CDK4的表達(dá)，阻止細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，抑制S期細(xì)胞合成有關(guān)[8]。

PDGF-BB是由多種細(xì)胞分泌的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是VSMC最有力的促有絲分裂原之一。球囊損傷血管后，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞、激活的血小板、移行于內(nèi)皮下的單核巨噬細(xì)胞以及表型轉(zhuǎn)化后的合成型VSMC都能以自分泌、旁分泌形式釋放大量的PDGF-BB。PDGF-BB與其膜表面受體結(jié)合，激活受體的內(nèi)源性酪氨酸激酶活性，通過(guò)磷酸化胞漿中的信號(hào)分子，最終將信息傳遞到核內(nèi)，導(dǎo)致VSMC增殖[19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，動(dòng)脈損傷后升高的PDGF-BB水平同新生內(nèi)膜細(xì)胞的增殖有關(guān)[20-22]。針對(duì)PDGF的抗PDGF抗體[13]，受體表達(dá)的反義寡核苷酸[23]，或使用PDGF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑都被證明可以減輕內(nèi)膜的增生?？偨Y(jié)這些研究結(jié)果表明，PDGF-BB在再狹窄中起著重要的作用。本研究結(jié)果表明，正常血管壁PDGF-BB表達(dá)微弱，動(dòng)脈損傷后血管壁PDGF-BB的表達(dá)升高，14 d表達(dá)水平最高，之后開(kāi)始下降，decoy OND治療后其表達(dá)減少。因此表明Egr-1 decoy ODN通過(guò)切割Egr-1mRNA，從而減少Egr-1的表達(dá)，這也就在一定程度上控制了PDGF-BB的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到抑制動(dòng)脈損傷后的內(nèi)膜增生出現(xiàn)概率。

綜上所述，通過(guò)本次研究，可以證實(shí)Egr-1誘騙寡核苷酸可以有效地對(duì)大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后的PDGF-BB進(jìn)行抑制，效果非常顯著，因此，在冠心病的臨床醫(yī)學(xué)研究當(dāng)中，可以將這種基因表達(dá)治療方法納入研究體系中，為患者的臨床治療提供一定參考，進(jìn)一步地進(jìn)行理論和實(shí)驗(yàn)研究后，為防治患者術(shù)后并發(fā)癥提供醫(yī)療保證，意義較強(qiáng)，研究也為臨床醫(yī)學(xué)提供一定參考。

[1]McCaffrey TA，F(xiàn)u C，Du C，et al.High-level expression of Egr-1 and Egr-1-inducible genes in mouse and human atherosclerosis [J].J Clin Invest，2000，105（5）：653-662.

[2]Levon M.Khachigian.Early Growth Response-1 in Cardiovascular Pathobiology[J].Circ Res，2006，98（2）：186-191.

[3]Santiago FS，Lowe HC，Kavurma MM，et al.New DNA enzyme targeting Egr-1 mRNA inhibits vascular smooth muscle proliferation and regrowth after injury[J].Nat Med，1999，5 （11）：1264-1269.

[4]Mann MJ，Dzau VJ.Therapeutic applications of transcription factor decoy oligo-nucleotides[J].J Clin Invest，2000，106（9）：1071-1075.

[5]Ryuichi M，Jitsuo H，Naruya T，et al.Application of transcription factor"decoy"strategy as means of gene therapy and study of gene expression in cardiovascular disease [J].Circ Res，1998，82 （10）：1023-1028.

[6]Schtmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C（T）method[J].Nat Protoc，2008，3（6）：1101-1108.

[7]Ohtani K，Egashira K，Usui M，et al.Inhibition of neointimal hyperplasia after balloon injury by cis-element‘decoy’ of early growth response gene-1 in hyper-cholesterolemic rabbits[J].Gene Therapy，2004，11（2）：126-132.

[8]張磊磊，司忠義.基質(zhì)金屬蛋白酶與血管損傷后再狹窄的防治[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（18）：2463-2466.

[9]Blaschke F，Bruemmer D，Law RE.Egr-1 is a major vascular pathogenic transcription factor in atherosclerosis and restenosis[J].Rev Endocr Metab Disord，2004，5（3）：249-254.

[10]Yoshimura S，Morishita R，Hayashi K，et al.Inhibition of intimal hyperplasia after balloon injury in rat carotid artery model using cis-element “decoy” of nuclear factor-kappa B binding site as a noved molecular strategy[J].Gene Ther，2001，21（8）：1635-1642.

[11]Nakamura T，Morishita R，Asai T，et al.Molecular strategy using cis-element'decoy'ofE2F bindingsiteinhibitsneointimal formation in porcine balloon-injured coronary artery model[J].Gene Ther，2002，9（8）：488-494.

[12]Han W，Liu GN.EGR-1 decoy ODNs inhibit vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia of balloon-injured arteries in rat[J].Life Science，2010，86（7-8）：234-243.

[13]王云雅，汪靜，鄧敬蘭，等.放射性PDGFR反義寡核苷酸對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].心臟雜志，2006，18（4）：388-390.

[14]Papaharalambus CA，Griendling KK.Basic mechanisms of oxidative stress and reactive oxygen species in cardiovascular injury[J].Trends Cardiovasc Med，2007，17（2）：48-54.

[15]Huang M，Duhadaway JB，Prendergast GC，et al.RhoB regulates PDGFR-beta trafficking and signaling in vascular smooth muscle cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27（12）：2597-2605.

[16]Seo JM，Jin YR，Ryu CK，etal.JM91，a newly synthesized indoledione derivative，inhibits rat aortic vascular smooth muscle cells proliferation and cell cycle progression through inhibition of ERK1/2 and Akt activations[J].Biochem Pharmacol，2008，75（6）：1331-1340.

[17]Uchida K，Sasahara M，Morigami N，et al.Expression of plateletderived growth factor B-chain in neointimal smooth muscle cells of balloon injured rabbit femoral arteries[J].Atherosclerosis，1996，124（1）：9-23.

[18]Yang X，Thomas DP，Zhang X，et al.Curcumin inhibits plateletderived growth factor-stimulated vascular smooth muscle cell function and injury-induced neointima formation [J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26（1）：85-90.

[19]Lim Y，Kim TJ，Jin YR，et al.Epothilone B inhibits neointimal formation after rat carotid injury through the regulation of cell cycle-related proteins [J].J Pharmacol Exp Ther，2007，321（2）：648-655.

[20]Ferns GA，Raines EW，Sprugel KH，et al.Inhibition of neointimal smooth muscle accumulation after angioplasty by an antibody to PDGF[J].Science，1991，253（5024）：1129-1132.

[21]SiroisMG，SimonsM，Edelman ER.Antisenseoligonucleotide inhibition of PDGFR-beta receptor subunit expression directs suppression of intimal thickening[J].Circulation，1997，95（3）：669-676.

[22]Panetta CJ，Miyauchi K，Berry D，et al.A tissue-engineered stent for cell-based vascular gene transfer[J].Hum Gene Ther，2002，13（3）：433-441.