劉 洋，胡大海，董茂龍，白曉智，李小強(qiáng)

負(fù)壓創(chuàng)面治療(negative pressure wound therapy，NPWT)已在臨床使用了20多年，大量文獻(xiàn)表明，NPWT治療針對(duì)創(chuàng)面愈合，尤其是對(duì)于復(fù)雜的難愈性創(chuàng)面能顯著控制創(chuàng)面感染［1］、縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間［2］。Kubiak 等［3］研究表明 NPWT 可以明顯減輕腹腔膿毒癥的全身炎性反應(yīng)，保護(hù)臟器功能。Steven等［4］的研究表明，NPWT能降低開(kāi)放性骨折創(chuàng)面中銅綠假單胞菌的含量，然而其作用機(jī)制還未徹底闡明。NPWT對(duì)深二度燒傷創(chuàng)面的早期應(yīng)用，能顯著降低燒傷淤滯帶的范圍，促進(jìn)創(chuàng)面愈合［5-6］。本研究建立了銅綠假單胞菌感染的小鼠燙傷創(chuàng)面模型，觀察NPWT治療對(duì)由創(chuàng)面感染導(dǎo)致膿毒癥小鼠病死率的影響，為進(jìn)一步探索其相關(guān)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年雄性C57小鼠108只，體質(zhì)量18～20 g，8～12周齡，清潔環(huán)境飼養(yǎng)，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要儀器與試劑 RNPT 1型負(fù)壓治療儀及一次性負(fù)壓治療海綿購(gòu)自山西以諾醫(yī)療科技有限公司，Xenogen IVIS 200小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)，由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)，DU@800分光光度儀由美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)。細(xì)菌熒光素酶目的基因luxCDABE標(biāo)記的野生型銅綠假單胞菌菌株P(guān)AO1-1ux由西北大學(xué)生命科學(xué)院段康民教授惠贈(zèng)，使用前將菌株擴(kuò)增培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以比濁法調(diào)整菌液濃度約達(dá)(1.0×109)cfu/ml。

1.3 動(dòng)物模型建立

1.3.1 燙傷動(dòng)物模型建立:用3%戊巴比妥鈉按40 mg/kg劑量腹腔注射行全身麻醉，背部脫毛。脫毛、用清水洗滌后擦干背部皮膚，在小鼠背部脫毛區(qū)正中部位，放置燙傷模具，開(kāi)啟蒸汽燙傷儀電源，將蒸汽噴頭伸入圓筒，保持在距離皮膚1 cm位置，形成一個(gè)直徑2 cm的Ⅲ度圓形燙傷創(chuàng)面，造成的燙傷深度采用病理切片證實(shí)。

1.3.2 燙傷后感染模型建立:燙傷實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，用體積分?jǐn)?shù)3%異氟烷吸入麻醉，麻醉成功后，1 ml注射器抽取(1.0 ×109)cfu/ml銅綠假單胞菌菌液 50 μl，緩慢注射于燙傷皮下，將動(dòng)物放回籠中，自然復(fù)蘇，單籠飼養(yǎng)，自由飲食。24 h后無(wú)菌條件下，剪去燙傷痂皮，用3%過(guò)氧化氫、甲硝唑、生理鹽水蘸洗創(chuàng)面2次。

1.4 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 NPWT對(duì)照實(shí)驗(yàn):健康雄性 C57小鼠60只按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組30只。

按照1.3.1 和 1.3.2 項(xiàng)建立模型后，分別進(jìn)行以下處理:實(shí)驗(yàn)組按創(chuàng)面形狀剪裁醫(yī)用海綿，將剪有3個(gè)側(cè)孔的塑料引流管的一端插入海綿，另一端用貼膜將海綿固定在創(chuàng)面上，然后接引流瓶和負(fù)壓泵，調(diào)節(jié)負(fù)壓為－125 mmHg，持續(xù)負(fù)壓吸引。對(duì)照組無(wú)菌生理鹽水濕敷(WTD)，單層凡士林紗布覆蓋創(chuàng)面后包扎固定。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天計(jì)為0 d。于0、1、3、5、7 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死6只小鼠留取標(biāo)本。

1.4.2 生存分析實(shí)驗(yàn):其余48只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為燙傷組、燙傷感染組、燙傷感染NPWT處理組和燙傷感染換藥組，每組12只。

均按1.3.1建立燙傷模型，燙傷感染組、燙傷感染NPWT處理組和燙傷感染換藥組按1.3.2建立感染模型。燙傷感染NPWT處理組給予創(chuàng)口持續(xù)負(fù)壓吸引，燙傷感染換藥組給予WTD治療。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 創(chuàng)面細(xì)菌熒光強(qiáng)度檢測(cè):在實(shí)驗(yàn)0、1、3、5、7 d，用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)標(biāo)記菌熒光強(qiáng)度，發(fā)光強(qiáng)度單位是光子/(秒·厘米2·單位角度)。通過(guò)檢測(cè)創(chuàng)面熒光標(biāo)記菌的相對(duì)表達(dá)量，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組熒光強(qiáng)度差異，以此來(lái)反映銅綠假單胞菌在小鼠創(chuàng)面的侵襲情況。

1.5.2 肺臟、肝臟、腎臟組織化學(xué)染色觀察:在實(shí)驗(yàn)第3天收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物器官樣本，進(jìn)行石蠟包埋、固定。取創(chuàng)面上緣皮膚組織、左肺下葉、肝右葉、整個(gè)右側(cè)腎臟為器官標(biāo)本，10%福爾馬林充分固定，依次進(jìn)行沖洗、常溫下不同濃度乙醇溶液脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，HE染色。光鏡下觀察，保存圖像并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.3 7 d生存分析:連續(xù)觀察7 d，記錄4組小鼠死亡時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行生存分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用兩樣本 t檢驗(yàn)。生存分析實(shí)驗(yàn)使用Kaplan-Meier法分析。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面細(xì)菌熒光強(qiáng)度 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，小鼠創(chuàng)面標(biāo)記菌的熒光表達(dá)量?jī)山M沒(méi)有明顯差異。1 d時(shí)對(duì)照組熒光表達(dá)量明顯升高，1、3、5 d時(shí)均顯著高于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.01)。其中在實(shí)驗(yàn)第3天熒光表達(dá)量達(dá)到最大值。治療第7天，兩組細(xì)菌熒光光子計(jì)數(shù)相似。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 兩組燙傷感染小鼠創(chuàng)面細(xì)菌熒光強(qiáng)度比較與對(duì)照組比較，bP＜0.01

2.2 肺、肝、腎組織化學(xué)染色比較 在光學(xué)顯微鏡下觀察各組組織切片，肺組織切片，對(duì)照組可見(jiàn)肺泡壁折疊、塌陷，炎性反應(yīng)明顯，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而實(shí)驗(yàn)組中肺組織炎性浸潤(rùn)明顯較輕，僅少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);肝組織切片中，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組組織水腫輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少;腎組織切片中，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，組織水腫輕，腎小管壞死數(shù)量少。見(jiàn)圖2。

表1 兩組燙傷感染小鼠創(chuàng)面細(xì)菌熒光強(qiáng)度比較［±s，×108光子/(秒·厘米2·單位角度)］

表1 兩組燙傷感染小鼠創(chuàng)面細(xì)菌熒光強(qiáng)度比較［±s，×108光子/(秒·厘米2·單位角度)］

注:實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用負(fù)壓創(chuàng)面治療，對(duì)照組應(yīng)用無(wú)菌生理鹽水濕敷。與對(duì)照組相同治療天數(shù)比較，bP＜0.01

組別 鼠數(shù)0 d 1 d 3 d 5 d 7 d對(duì)照組 30 7.9±2.8 44.0±11.0 47.0±17.0 15.0±29.0 4.8 2.9±2.3±1.8實(shí)驗(yàn)組 30 11.0±6.8 2.9±2.5b 6.6±1.9b 3.9±5.6b

2.3 生存率統(tǒng)計(jì)分析 7 d內(nèi)燙傷組全部存活，燙傷感染NPWT組生存率顯著高于燙傷感染組(P＜0.05)，燙傷感染NPWT組與燙傷感染換藥組生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。前3 d燙傷感染NPWT組死亡率顯著低于燙傷感染換藥組(25%VS 41.7%，P ＜0.05)，見(jiàn)表2 和圖3。

圖2 兩組燙傷感染3 d小鼠器官組織病理圖(HE)

表2 4組燙傷小鼠7 d內(nèi)死亡數(shù)及生存率(例)

圖3 4組燙傷小鼠7 d內(nèi)生存曲線圖

3 討論

許多資料顯示NPWT作用機(jī)制可能與抑制細(xì)菌在創(chuàng)面組織中擴(kuò)散密切相關(guān)［7］。Morykwas［8］發(fā)現(xiàn)NPWT能夠有效地清除豬背部創(chuàng)面的細(xì)菌。隨后，Moues［9］通過(guò)觀察證明NPWT相比常規(guī)濕敷換藥能有效減少創(chuàng)面革蘭陰性菌數(shù)量。這些證據(jù)說(shuō)明NPWT能夠抑制某些細(xì)菌在創(chuàng)面增殖，但這些實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)分泌物培養(yǎng)法來(lái)測(cè)定細(xì)菌種類，定量細(xì)菌，無(wú)法觀察致病菌侵襲的范圍和擴(kuò)散程度，對(duì)整個(gè)創(chuàng)面細(xì)菌分布情況難以完整系統(tǒng)的了解。因此，不能充分反映NPWT對(duì)創(chuàng)面及深部組織細(xì)菌的抑制作用，也無(wú)法反映治療效果。此外，NPWT清除燒傷創(chuàng)面的銅綠假單胞菌感染的作用也有待進(jìn)一步研究。

為了解決上述問(wèn)題，本研究建立了細(xì)菌熒光素酶標(biāo)記的銅綠假單胞菌感染的小鼠燒傷創(chuàng)面模型，分別使用NPWT或WTD治療，觀察標(biāo)記菌在創(chuàng)面擴(kuò)散的情況并量化標(biāo)記菌數(shù)。結(jié)果表明，NPWT治療在早期(治療72 h)即能顯著降低標(biāo)記菌的熒光光子計(jì)數(shù)，然而在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(治療第7天)，兩組細(xì)菌熒光光子計(jì)數(shù)相似。這一結(jié)果表明，NPWT在感染早期治療效果明顯優(yōu)于WTD，同時(shí)WTD不能抑制銅綠假單胞菌在創(chuàng)面的增殖和侵襲，雖然在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)兩組細(xì)菌熒光光子計(jì)數(shù)相似，但結(jié)合治療后生存率比較，使用WTD的小鼠生存率仍低于應(yīng)用NPWT小鼠。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示在第1次使用NPWT后細(xì)菌熒光表達(dá)量即明顯降低，然而對(duì)照組在第一次治療后的3 d仍顯著持續(xù)增加。以上結(jié)果表明，在燒傷感染早期使用NPWT能夠有效減少創(chuàng)面組織細(xì)菌含量，這為臨床使用NPWT提供了一定的借鑒價(jià)值。

7 d生存分析顯示，應(yīng)用NPWT和WTD治療后，模型小鼠的死亡率分別下降到50.0%和66.7%。雖然生存率NPWT和換藥組之間沒(méi)有顯著差異，但在小鼠死亡最快的前3 d中，死亡率統(tǒng)計(jì)NPWT組較對(duì)照組明顯降低(25%VS 41.7%，P＜0.05)，結(jié)果提示NPWT治療能減少銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面導(dǎo)致的燒傷創(chuàng)面膿毒癥的死亡率。

組織病理學(xué)檢查顯示NPWT組中內(nèi)臟器官的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞損傷低于對(duì)照組。表明NPWT在減輕體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和保護(hù)內(nèi)臟器官方面起到了積極的作用。

綜上所述，在感染創(chuàng)面早期使用NPWT能夠快速降低創(chuàng)面細(xì)菌含量，緩解全身炎性失控性反應(yīng)，減輕臟器損傷，降低燒傷創(chuàng)面膿毒癥的發(fā)病率和死亡率，本研究為臨床NPWT的使用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在未來(lái)研究中，我們還將以此為基礎(chǔ)，繼續(xù)探索NPWT在治療燒傷創(chuàng)面感染中的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)制，為進(jìn)一步合理高效的使用該技術(shù)提供理論支持和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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