黃海東，王明月，郭 穎，管 迪，李鴻甫，尹 祿

目前翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制尚未明確，流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果顯示，翼狀胬肉多發(fā)生于生活在多塵、日照強(qiáng)烈及炎熱等環(huán)境的人群中，一些戶外工作者也容易發(fā)生翼狀胬肉［1］。有研究者用大劑量的紫外線照射大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠角膜基質(zhì)血管形成、前彈力層變性、上皮增生，因此認(rèn)為紫外線與翼狀胬肉的發(fā)生關(guān)系密切，這可能是環(huán)境因素中最重要的因素［2］。Pax6是一種與眼球發(fā)育有關(guān)的基因，無(wú)論是低等線蟲還是高等生物人類的眼球發(fā)育中，Pax6均發(fā)揮了一定的作用，而基因突變可以引發(fā)嚴(yán)重異常發(fā)育。近些年來(lái)，隨著研究的深入，已經(jīng)證實(shí)了在晶體及視網(wǎng)膜發(fā)育中Pax6的重要性，但關(guān)于眼表面上皮細(xì)胞中Pax6異常表達(dá)的研究很少。筆者應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)Pax6在翼狀胬肉中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)用 K19、K10、MUC5AC檢測(cè)翼狀胬肉上皮鱗狀分化，探討Pax6在翼狀胬肉上皮鱗狀化生中的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年5月—2012年7月我院眼科25例翼狀胬肉標(biāo)本為觀察組，均符合翼狀胬肉診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］;同時(shí)選擇25例健康眼結(jié)膜標(biāo)本為對(duì)照組，眼科檢查除外沙眼、過(guò)敏性結(jié)膜炎、慢性淚囊炎、瞼緣炎以及患有其他眼部病變的病例，所有入選病例均無(wú)眼科長(zhǎng)期用藥史。其中觀察組男11例，女14例，年齡30～65(45.3±10.4)歲，右眼10例，左眼15例。對(duì)照組男12例，女13例，年齡33～69(45.6±11.5)歲，右眼9例，左眼16例。兩組眼結(jié)膜標(biāo)本提供者在年齡、性別上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 翼狀胬肉手術(shù)方法:常規(guī)消毒手術(shù)部位，采用表面麻醉，將2%的利多卡因注射于翼狀胬肉結(jié)膜下，用剪刀在顯微鏡下將正常眼結(jié)膜與翼狀胬肉分離，剪除分離的翼狀胬肉，同時(shí)將變性的結(jié)膜下組織清除，必要時(shí)可應(yīng)用燒灼止血。然后沿0.5 mm透明角膜區(qū)劃切，剝離包括胬肉頭部的角膜淺層，在球結(jié)膜上方取一塊游離球結(jié)膜組織植片(包括角膜緣上皮組織)，拖到原胬肉植床處，將組織植片展平，與相應(yīng)角膜緣對(duì)應(yīng)。將植片對(duì)位間斷縫合，于鞏膜淺層固定。手術(shù)完畢后將妥布霉素地塞米松眼膏涂至結(jié)膜囊，包扎手術(shù)眼部。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色法:選擇鼠抗人單克隆抗體 Pax6、K19 及 K10、MUC5AC，DAPI、OCT 包埋劑，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，冰凍切片機(jī)(Leica CM1850)，倒置熒光顯微鏡(Nikon TE2000)。用4%多聚甲醛固定組織切片15 min，然后置于過(guò)氧化氫甲醇溶液(0～3%)中30 min，將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活。用PBS清洗標(biāo)本3次，每次清洗5 min，將第一抗體(已經(jīng)過(guò)血清稀釋液稀釋)加入，在4℃冰箱中孵育過(guò)夜，將抗體吸除，PBS清洗3次，每次清洗15 min。將生物素標(biāo)記兔抗鼠二抗(已經(jīng)過(guò)血清稀釋液稀釋)滴加入標(biāo)本中，在室溫下孵育1 h，然后吸除抗體，再次用PBS洗滌，每次清洗5 min，共清洗3次。加入親和素－生物素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)，孵育 30 min，用 PBS洗滌，每次清洗5 min，共清洗3次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色50 s，反應(yīng)終止。用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片(中性樹膠)。在光鏡下進(jìn)行觀察并照相。PBS代替一抗行陰性對(duì)照。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù) Pax6、K19、K10及MUC5AC在正常眼結(jié)膜組織及翼狀胬肉兩組標(biāo)本中的表達(dá)情況及吸光度值評(píng)價(jià)Pax6在翼狀胬肉上皮鱗狀化生中的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Pax6陽(yáng)性表達(dá)情況及吸光度值比較 對(duì)照組上皮細(xì)胞全層均有 Pax6大量表達(dá)，吸光度值為46710±3712;觀察組上皮細(xì)胞Pax6表達(dá)量顯著降低，以基底層上皮細(xì)胞丟失的Pax6最顯著，吸光度值為31984±5413，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.011，P=0.000)。

2.2 上皮細(xì)胞表型K19、K10陽(yáng)性表達(dá)吸光度值比較 兩組K10及K19陽(yáng)性表達(dá)吸光度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，見表1。

2.3 黏蛋白MUC5AC陽(yáng)性表達(dá)情況及吸光度值比較 觀察組MUC5AC陽(yáng)性表達(dá)吸光度值平均為702±894;對(duì)照組MUC5AC陽(yáng)性表達(dá)吸光度值平均為7132±2784。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.136，P=0.000)。

表1 翼狀胬肉與正常眼結(jié)膜標(biāo)本上皮細(xì)胞表型K19、K10陽(yáng)性表達(dá)吸光度值比較(±s)

表1 翼狀胬肉與正常眼結(jié)膜標(biāo)本上皮細(xì)胞表型K19、K10陽(yáng)性表達(dá)吸光度值比較(±s)

注:觀察組:翼狀胬肉標(biāo)本，對(duì)照組:健康眼結(jié)膜標(biāo)本

組別 例數(shù)K19 K10觀察組25 8287±7003 8094±1746對(duì)照組 25 24985±13993 0 5.032 5.102 P t 0.000 0.000

3 討論

在各種生物眼睛發(fā)育的過(guò)程中均有Pax6轉(zhuǎn)錄因子的存在，甚至是在果蠅等昆蟲中，Pax6都是眼睛分化過(guò)程的要素之一［4］。含有配對(duì)盒基因序列是Pax基因家族共同的特點(diǎn)，人們首先在果蠅體節(jié)基因發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)。相關(guān)的研究表明，脊椎動(dòng)物共有Paxl-Pax99組Pax基因，Pax6是人類無(wú)虹膜基因，約25 kb，由至少14個(gè)外顯子組成。無(wú)論在非脊椎動(dòng)物還是脊椎動(dòng)物中，Pax6基因均十分保守，在生物生長(zhǎng)及發(fā)育具有重要意義。到目前為止，人們發(fā)現(xiàn)了70余種與鼠眼發(fā)育相關(guān)的、已經(jīng)定位的基因，其中最重要的基因即為Pax6，其具有高度保守的表達(dá)方式，在遺傳性眼病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮一定作用［5-6］。

鱗狀上皮化生是一種病理過(guò)程，是Stevens-Jobnson綜合征、維生素A缺乏綜合征、熱/化學(xué)傷、干燥綜合征、眼類天皰瘡等多種嚴(yán)重眼科疾病出現(xiàn)干眼表現(xiàn)的標(biāo)志。李明淵等［7］對(duì)50例翼狀胬肉患者眼表變化進(jìn)行了檢查，發(fā)現(xiàn)所有患者翼狀胬肉表面的結(jié)膜均有不同程度的鱗狀上皮化生。K19作為角質(zhì)蛋白是細(xì)胞的骨架蛋白［8］，在正常結(jié)膜上皮中，是一種重要的組成蛋白［9］。在正常結(jié)膜上皮中，K10并不表達(dá)，在角化上皮中是終末分化標(biāo)志物。MUC5AC是淚膜黏液層的重要組成成分，具有維持淚膜穩(wěn)定性的重要作用，還對(duì)淚膜在眼表分布起促進(jìn)作用［10］。MUC5AC在正常結(jié)膜組織上皮表皮層中呈簇狀散在或者單個(gè)分布，在翼狀胬肉組織中表達(dá)明顯減弱，大多數(shù)上皮并無(wú)MUC5AC表達(dá)。本研究結(jié)果證實(shí)，MUC5AC及K19在翼狀胬肉上皮中的表達(dá)下降明顯，而K10則出現(xiàn)了較多的陽(yáng)性表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明翼狀胬肉上皮有鱗狀上皮化生發(fā)生［11］。Pax6在胚胎眼發(fā)育中是起主導(dǎo)作用的基因，在眼組織多種類型的上皮細(xì)胞中均有表達(dá)。出生后，Pax6主要在眼部晶狀體上皮細(xì)胞、角結(jié)膜、視網(wǎng)膜無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、虹膜等處表達(dá)，而在皮膚上皮中無(wú)表達(dá)［12］。眼球發(fā)育很可能因?yàn)镻ax6基因突變而出現(xiàn)異常，導(dǎo)致遺傳性角膜炎、先天性無(wú)虹膜等疾病發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)主要研究翼狀胬肉發(fā)病過(guò)程中Pax6上皮鱗狀化生中的意義，發(fā)現(xiàn)正常眼結(jié)膜上皮細(xì)胞全層均有Pax6大量表達(dá)，翼狀胬肉上皮細(xì)胞Pax6表達(dá)量顯著降低，以基底層上皮細(xì)胞丟失的Pax6最顯著。

綜上所述，Pax6基因具有調(diào)控并維持眼表面結(jié)膜上皮表型正常的作用，其表達(dá)下降可能促進(jìn)翼狀胬肉出現(xiàn)鱗狀上皮化生［13］。因此，治療翼狀胬肉時(shí)采用基因治療技術(shù)［14-16］，應(yīng)用分化抑制劑或者將Pax6基因?qū)胍頎铈廊猱惓７只纳掀ぶ?，?yīng)該能夠成為治療翼狀胬肉的有效方法［17-22］。

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