楊麗麗，潘偉斌，溫 勇，陳 群，3

(1.華南理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640;2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東廣州510655;3.廣東省建筑科學(xué)研究所，廣東廣州 510500)

隨著全球水體富營(yíng)養(yǎng)化程度的加劇，有害藻類水華的爆發(fā)日趨頻繁，其造成的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)等問(wèn)題日益引起人們關(guān)注。目前，對(duì)藻類水華的治理主要有物理、物理化學(xué)、化學(xué)、生物等方法。物理、物理化學(xué)及化學(xué)等方法存在能耗大、投資高、對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的破壞效應(yīng)大以及可能產(chǎn)生二次污染等問(wèn)題，而生物調(diào)控在富營(yíng)養(yǎng)化湖泊的治理中已體現(xiàn)出明顯的效果，且具有費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)，但許多成功的實(shí)例往往是短期的。

隨 著 微 生 物 工 程 的 崛 起， 細(xì) 菌［1－2］、 真菌［3－4］、病毒［5］、藻類和放線菌等微生物成為調(diào)節(jié)有害藻類種群動(dòng)態(tài)的重要潛在因子。其中，溶藻細(xì)菌 (algicidal bacteria)作為一種有特異性殺藻作用的微生物，具有潛在的水體富營(yíng)養(yǎng)化治理應(yīng)用價(jià)值，國(guó)內(nèi)外在此領(lǐng)域開(kāi)展了廣泛的研究，研究?jī)?nèi)容主要集中在溶藻細(xì)菌的分離鑒定及其溶藻特性［6］、溶藻活性物質(zhì)的分離鑒定［7］和溶藻機(jī)制［8］等方面，利用溶藻細(xì)菌治理水體雖略有報(bào)道［9］，但利用溶藻細(xì)菌開(kāi)發(fā)生物殺藻劑的工程應(yīng)用實(shí)例鮮有報(bào)道。

目前報(bào)道的生物殺藻劑或生物抑藻劑多從兩方面制備:一是將水生植物體［10］或其它植物體［11］粉碎后提取制備;二是將具有一定殺藻或抑藻作用的單種或多種細(xì)菌菌體連同培養(yǎng)基等其它物質(zhì)混合后制成菌劑，并直接投放到水體中使用，該菌劑多有應(yīng)用報(bào)道［12］，但直接向水體中投放菌劑存在潛在的生物安全性、引入外來(lái)營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

可見(jiàn)，開(kāi)發(fā)一種高效、安全、具特異性的生物活性殺藻劑并將其應(yīng)用于藻類水華的應(yīng)急治理具有重要意義。與直接投加富含溶藻細(xì)菌的菌劑相比，將溶藻活性物質(zhì)分離提純后制成生物殺藻劑，其生態(tài)安全性更高。

作者針對(duì)一株溶藻細(xì)菌 L7(以下簡(jiǎn)稱“L7”)，從細(xì)菌高密度培養(yǎng)、物質(zhì)提純鑒定兩方面著手，探索溶藻細(xì)菌高密度培養(yǎng)的工藝參數(shù)及溶藻活性物質(zhì)提純鑒定的關(guān)鍵技術(shù)，為生物殺藻劑的研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 溶藻細(xì)菌

L7為研究組于2005年從廣州市黃埔區(qū)某富營(yíng)養(yǎng)化池塘水華暴發(fā)后期的水樣中分離出的一株溶藻細(xì)菌［6］，該溶藻細(xì)菌對(duì)藻的作用時(shí)間短、針對(duì)性強(qiáng)，避免了外來(lái)微生物不適應(yīng)本土富營(yíng)養(yǎng)化水體、難以獲得理想的溶藻效果、與將來(lái)工程實(shí)際應(yīng)用相距甚遠(yuǎn)的弊端。L7屬于蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus ce-reus)，其在 GeneBank的登錄號(hào)為 DQ459876(strain L7)。

1.2 溶藻細(xì)菌培養(yǎng)基

L7菌種以牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基［13］于4℃冷藏保存。在L7高密度培養(yǎng)階段，以淀粉培養(yǎng)基［13］為參考培養(yǎng)基，考察適宜高密度培養(yǎng)L7的碳源、氮源、C/N質(zhì)量比、初始pH值及培養(yǎng)條件，最終確定的細(xì)菌培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件詳見(jiàn)結(jié)論。

1.3 無(wú)菌濃縮液

取無(wú)菌濾液［14］，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器65℃真空旋蒸濃縮至原體積的1/2，得2倍無(wú)菌濃縮液;相同方法制得10倍、100倍無(wú)菌濃縮液。將所得無(wú)菌濃縮液裝入已高溫滅菌的具塞錐形瓶中，于4℃冷藏備用。

1.4 供試藻種及藻苔制備

選用的藻種為水華魚(yú)腥藻 (Anabaena flosaquaeFACHB－245)，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種保藏中心，以BG11為培養(yǎng)基［15］，在溫度 (23±0.5)℃，光照強(qiáng)度3 000 lux，光暗周期比為14 h∶10 h的條件下培養(yǎng)，藻液備用。

在液體BG11培養(yǎng)基中加入w=1.5%的瓊脂條，高溫滅菌。取10 mL水華魚(yú)腥藻液，在4000 r/min下離心5 min，棄去上清液，在培養(yǎng)基尚處于液體狀態(tài)時(shí)，將其倒入離心管，使藻液再懸浮，然后倒平板，每個(gè)平板倒15 mL，靜置待其冷卻凝固后獲得水華魚(yú)腥藻固體平板，即供試藻苔。將藻苔放于人工氣候箱中，在與供試藻液相同的培養(yǎng)條件下倒置培養(yǎng)，藻苔備用。

1.5 儀器及試劑

本研究中選用的儀器包括:LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，TDL-40B低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，LRH-250生化培養(yǎng)箱，LRH-250-GS人工氣候箱，DHZ-CA大容量恒溫振蕩器，TU-1800SPC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，YGF300-10 L微生物發(fā)酵罐，RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Leica DME顯微鏡，VP32真空抽濾泵，戴安U3000液相色譜儀，Thermo Heto Ultra Freeze 3410超低溫冰箱，大容量離子阱LC/MSn液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀等。

本研究中使用的主要試劑包括:葡聚糖凝膠Sephadex LH-20購(gòu)自 GE Healthcare，甲醇 (色譜純)購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.6 溶藻效果的判定

對(duì)比葉綠素a含量變化的方法 (葉綠素a去除率［9］)只適用于量大的供試液，檢測(cè)量少的供試液的溶藻效果則用杯碟法。檢測(cè)凝膠柱層析各洗脫組分的溶藻效果的具體方法為:取2 mL洗脫組分，80℃水浴蒸干 (目的是去甲醇，因?yàn)榧状季哂泻軓?qiáng)的殺藻能力)，滅菌后加入0.5 mL無(wú)菌水，震蕩溶解，再按照杯碟法檢測(cè)溶藻活性。

1.7 溶藻細(xì)菌L7的高密度培養(yǎng)

1.7.1 繪制L7菌液的吸光度與細(xì)菌濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 取細(xì)菌濃度不同的10個(gè)樣，用比濁法測(cè)定其在450 nm下的吸光度 (A應(yīng)在0.1～1.5范圍)，同時(shí)用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算其細(xì)菌數(shù)，從而得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.7.2 篩選適宜L7生長(zhǎng)的碳源、氮源 以淀粉培養(yǎng)基為參比，以相同的量將其中的碳源 (淀粉)分別換成葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖;以相同的量將其中的氮源 〔(NH4)2SO4〕分別換成KNO3、NH4NO3、NH4Cl、尿素。將L7在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，每個(gè)斜面用10 mL無(wú)菌水洗脫菌苔，將菌懸液以5.4×107cfu/mL的接種量接種到200 mL含有各種不同碳源、氮源的液體培養(yǎng)基中，將接種后的液體培養(yǎng)基裝入250 mL已滅菌的具塞錐形瓶，置于恒溫振蕩器中。以30℃恒溫、100 r/min轉(zhuǎn)速，振蕩培養(yǎng)7 d，每隔12 h取15 mL樣，應(yīng)用比濁法測(cè)定細(xì)菌濃度。每組實(shí)驗(yàn)組設(shè)2個(gè)平行。

選取對(duì)L7生長(zhǎng)具有最大促進(jìn)作用的碳源、氮源作為下一步考察適宜L7生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配比、細(xì)菌接種量及培養(yǎng)條件的營(yíng)養(yǎng)成分。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)置表Table 1 Setup the orthogonal test

1.7.3 考察適宜L7生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配比及細(xì)菌接種量 設(shè)置3因素4水平正交實(shí)驗(yàn)，考察不同初始pH 值 (6.5、7.0、7.5、8.0)、細(xì) 菌 接 種 量(1.22×108、6.1×107、4.1×107、3.1×107cfu/mL)、C/N 質(zhì)量比 (3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)對(duì) L7生長(zhǎng)的影響。

1.7.4 考察適宜L7生長(zhǎng)的A值及攪拌速率 利用10 L自動(dòng)玻璃發(fā)酵罐，裝液量6 L，除A值及攪拌速率外，培養(yǎng)基配方如結(jié)論所示，考察兩種條件組合對(duì)L7生長(zhǎng)的影響，這兩組條件分別是A30%(±10%)+攪拌速率160(±10)r/min、A80%(±10%)+攪拌速率30(±10)r/min。

1.8 溶藻細(xì)菌L7溶藻活性物質(zhì)的提純鑒定

1.8.1 透析 將10 mL 10倍無(wú)菌濃縮液分別裝入截留相對(duì)分子質(zhì)量為1 000、2 000、3 500的透析袋中，將透析袋放入盛有500 mL蒸餾水的1 000 mL玻璃燒杯中，置于恒溫振蕩器30℃、100 r/min條件下振蕩透析。透析24 h，透析期間每8 h換一次蒸餾水。透析完成后，收集透析袋內(nèi)保留液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將其濃縮至10 mL，取5 mL濃縮液稀釋至20 mL，測(cè)定其溶藻效果，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行。以未經(jīng)任何處理的2.5倍無(wú)菌濃縮液和無(wú)菌水作為對(duì)照。

1.8.2 凝膠柱層析 經(jīng)四氯化碳萃取［14］后的35 mL 100倍無(wú)菌濃縮液分裝入3個(gè)34×200 mm的透析袋 (截留的相對(duì)分子質(zhì)量為3 500)中，將透析袋放入裝1 L蒸餾水的2 L燒杯中，置于恒溫振蕩器30℃、100 r/min條件下振蕩透析。透析24 h，透析期間每8 h換一次蒸餾水，最終收集袋外所有的透析液。

將袋外透析液濃縮至20 mL，用一次性0.22 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾除菌及雜質(zhì)，真空冷凍干燥制得凍干粉。稱取3 g凍干粉，溶于10 mL甲醇中，取甲醇溶解相過(guò)0.22 μm的微孔濾膜 (有機(jī)系)，上樣2.5 mL，凝膠柱層析的洗脫劑為甲醇，洗脫速度為2 mL/min。用10 mL的比色管對(duì)洗脫組分進(jìn)行逐一收集，最終共獲得50個(gè)洗脫組分 (分別編號(hào)1號(hào)～50號(hào))。

對(duì)所獲得的50個(gè)洗脫組分進(jìn)行紫外光譜掃描，用杯碟法檢測(cè)具有特征吸收峰的洗脫組分的溶藻活性，從而篩選出具有溶藻活性的洗脫組分。

1.8.3 高效液相色譜 利用高效液相色譜分析1.8.2中所選出的有溶藻活性的洗脫組分 (7號(hào)、9號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、14號(hào))的物質(zhì)成分分離情況，以甲醇 (AR)為空白對(duì)照。高效液相色譜的分離條件為:柱溫35℃、流速1.0 mL/min、流動(dòng)相v(甲醇)∶v(水)=70∶30、柱壓 130 ×105Pa、進(jìn)樣量 10 μL。

1.8.4 液質(zhì)聯(lián)用 利用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀，分析7號(hào)、12號(hào)洗脫組分中所含物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，以甲醇 (AR)為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶藻細(xì)菌L7的高密度培養(yǎng)

2.1.1 繪制L7菌液的吸光度與細(xì)菌濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 L7菌液的吸光度 (A450nm)與細(xì)菌濃度的數(shù)學(xué)關(guān)系為

比濁法只適用于測(cè)定生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期之前(包括穩(wěn)定期)的菌液，同時(shí)，在測(cè)定細(xì)菌濃度的過(guò)程中要通過(guò)鏡檢關(guān)注細(xì)菌的生長(zhǎng)形態(tài)，以確保培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)正常。

2.1.2 篩選適宜L7生長(zhǎng)的碳源、氮源 在供試碳源中，當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)，L7生長(zhǎng)情況最好，約108 h到達(dá)穩(wěn)定期，菌液最高細(xì)菌濃度為1.83×108cfu/mL，與淀粉培養(yǎng)基相比，能使細(xì)菌生長(zhǎng)量提高34.86%;在供試氮源中，當(dāng)?shù)礊槁然@時(shí)，L7生長(zhǎng)情況最好，約48 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌液最高細(xì)菌濃度為1.87×108cfu/mL，與淀粉培養(yǎng)基相比，能使細(xì)菌生長(zhǎng)量提高37.74%;當(dāng)硫酸銨作為氮源時(shí)，對(duì)L7的生長(zhǎng)促進(jìn)作用較好，但不及氯化銨;其余供試碳源和氮源對(duì)L7生長(zhǎng)的促進(jìn)影響不顯著。

2.1.3 考察適宜L7生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配比及細(xì)菌接種量 取培養(yǎng)第3 d的數(shù)據(jù)做正交分析，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表2。影響水平為初始pH值＞C/N質(zhì)量比＞接種量，三個(gè)因素的各水平都具有顯著性差異(P＜0.05)，確定最適宜L7生長(zhǎng)的條件為:初始pH值7.5、C/N質(zhì)量比3∶1，細(xì)菌接種量3.1×107cfu/mL。

2.1.4 考察適宜L7生長(zhǎng)的A值及攪拌速率A30%(±10%)+攪拌速率160(±10)r/min條件下，L7細(xì)菌濃度呈不斷升高的趨勢(shì)，最高可達(dá)5.30×108cfu/mL，約為初始細(xì)菌濃度的19倍。A80%(±10%)+攪拌速率30(±10)r/min條件下，L7細(xì)菌濃度最高達(dá)到1.25×108cfu/mL，且24 h后生長(zhǎng)略呈下降趨勢(shì)。由圖1可知，A30%(±10%)+攪拌速率160(±10)r/min的條件較適宜L7的高密度培養(yǎng)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of the orthogonal test

圖1 兩種條件下L7菌液的A值變化Fig.1 Curves of A450nm(AU)of L7 under two different conditions

2.2 溶藻細(xì)菌L7溶藻活性物質(zhì)的提純鑒定

2.2.1 透析 經(jīng)過(guò)不同規(guī)格的透析袋處理后，各透析袋內(nèi)保留樣加入藻液5 d后的葉綠素a含量情況見(jiàn)圖2。2.5倍無(wú)菌濃縮液 (以下簡(jiǎn)稱“原樣”)的葉綠素a去除率為79.3%，截留相對(duì)分子質(zhì)量分別為3 500、2 000、1 000的透析袋內(nèi)的保留樣的葉綠素a去除率分別為－33.7%、－49.7%、－71.7%。通過(guò)用SPSS軟件進(jìn)行顯著性差異分析，各透析袋內(nèi)保留樣和原樣的葉綠素a去除率都存在顯著性差異 (P＜0.05)，故判斷L7溶藻活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000。

2.2.2 凝膠柱層析 凝膠柱層析的分離效果良好，9號(hào)、10號(hào)在220 nm處有吸收峰 (肩峰)，12號(hào)、13號(hào)在220、270 nm處有明顯吸收峰，19號(hào)以后的洗脫組分不具強(qiáng)吸收峰，且峰形幾乎一致。

圖2 原樣和各透析袋內(nèi)保留樣加入藻液5 d后葉綠素a含量對(duì)比Fig.2 Effect of dialysis samples on the content of Chla after 5 d

選擇7號(hào)～14號(hào)作為檢測(cè)溶藻活性的洗脫組分，溶藻活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。7號(hào)～14號(hào)都有一定的溶藻效果，其中12號(hào)最早出現(xiàn)溶藻效果，11號(hào)的溶藻效果最強(qiáng)，無(wú)菌水無(wú)抑藻圈，無(wú)菌濾液有明顯抑藻圈，可以判定7號(hào)～14號(hào)的洗脫組分都具有溶藻效果。

圖3 7號(hào)～14號(hào)、無(wú)菌水 (W)、無(wú)菌濾液(F)溶藻效果對(duì)比圖Fig.3 Algicidal effect of No.7～No.14，sterile water and sterile filtrate

2.2.3 高效液相色譜 7號(hào)在3.476 min處有較強(qiáng)吸收峰，9號(hào)在2.533 min、3.075 min處有較強(qiáng)吸收峰，11號(hào)在2.658 min、3.067 min處有較強(qiáng)吸收峰，12號(hào)在2.550 min處有較強(qiáng)吸收峰，14號(hào)在2.592 min處有較強(qiáng)吸收峰。由此推斷7號(hào)、12號(hào)中的物質(zhì)成分單一，而9號(hào)、11號(hào)中分別含有7號(hào)和12號(hào)不同的物質(zhì)成分，14號(hào)與12號(hào)的物質(zhì)成分一致。

圖4 7號(hào)、12號(hào)質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of samples No.7 and No.12

2.2.4液質(zhì)聯(lián)用 7號(hào)、12號(hào)詳細(xì)的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4。由圖4可知，7號(hào)內(nèi)所含溶藻活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量約為588.2，12號(hào)內(nèi)所含溶藻活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量約為365.0，精確相對(duì)分子質(zhì)量的確定還需對(duì)這兩種物質(zhì)進(jìn)一步提純后應(yīng)用更精密的鑒定儀器。由此可知，L7分泌的溶藻活性物質(zhì)可能有兩種，其相對(duì)分子質(zhì)量分別約為588.2、365.0。結(jié)合圖3分析，12號(hào)內(nèi)所含溶藻活性物質(zhì)的溶藻活性比7號(hào)內(nèi)所含溶藻活性物質(zhì)的溶藻活性強(qiáng)。

3 結(jié)論

1)在L7的高密度培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基配方及其培養(yǎng)條件:葡萄糖6 g，K2HPO41 g，NaCl 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，NH4Cl 2 g，蒸餾水 1 L，pH 7.5，細(xì)菌接種量為3.1×107cfu/mL，A值為30%(±10%)，攪拌速率為160(±10)r/min。在此情況下，細(xì)菌生長(zhǎng)量最高能達(dá)到5.30×108cfu/mL，約為初始細(xì)菌濃度的19倍。

2)在溶藻活性物質(zhì)的提純鑒定階段，對(duì)四氯化碳萃取后的無(wú)菌濾液進(jìn)行透析處理 (用相對(duì)分子質(zhì)量為3 500的透析袋)并收集、濃縮袋外透析液，繼而將樣品通過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，所獲得的不同洗脫組分分別在220、270 nm處或同時(shí)在該兩個(gè)波長(zhǎng)處有紫外吸收峰，最終獲得兩種溶藻活性物質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量分別約為588.2、365.0，相較而言，相對(duì)分子質(zhì)量為365.0的物質(zhì)的溶藻作用更強(qiáng)。

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