王曉娟 孫兆林 季宇彬 李志雄

(1哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱，150076;2中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海)

梔子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果實(shí)，味苦、性寒，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效，主治熱病心煩、黃疸尿赤、淋證澀痛、血熱吐衄，也可外治扭挫傷痛［1］。梔子中主要成分為環(huán)烯醚萜類，梔子苷、京尼平苷龍膽二糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯等是梔子中的主要生物活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明他們具有抗炎、利膽、鎮(zhèn)靜、抗老年癡呆等作用［2－3］。目前，有研究發(fā)現(xiàn)梔子還有抗流感病毒活性，吸收入血的有效成分含有梔子苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、山梔苷甲酯［4］等。對(duì)梔子進(jìn)行含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道多是單獨(dú)測(cè)定梔子苷，我們建立同時(shí)測(cè)定去乙酰車葉草苷酸甲酯和梔子苷含量的方法，為梔子資源的充分利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100色譜系統(tǒng)和英譜色譜工作站，KS5200H超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，梔子苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)，批號(hào):110749－200714，去乙酰車葉草苷酸甲酯，實(shí)驗(yàn)室自制，對(duì)照品純度均＞98%，分析天平(梅特勒－托利多XS105DU)。

乙腈(色譜純)，水(二次蒸餾水)，其他試劑均為分析純，梔子藥材購(gòu)自上海康橋中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB－C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 －0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫:0 min→6 min→20 min→28 min→32 min，乙腈5%→10%→15%→40%→5%，檢測(cè)波長(zhǎng):238 nm，流速:1.0 mL/min，柱溫:25℃，進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取梔子苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇制成濃度分別為0.846 mg/mL、0.186 mg/mL的對(duì)照品溶液，將兩個(gè)對(duì)照品溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后制成混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備 稱取梔子粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液過(guò)濾，即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL，依法測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1所示。去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷保留時(shí)間分別為 10.0 min、22.5 min，理論塔板數(shù)分別為19354、36296，與相鄰峰的分離度均大于1.5。

圖1 梔子HPLC色譜圖

2.5 線性范圍的考察 分別精密吸取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL 置 10 mL 容量瓶中用50%甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:去乙酰車葉草苷酸甲酯:A=18364C+30964，r=0.9994，線性范圍為 0.009 ～0.186 mg/mL，梔子苷:A=23495C+238661，r=0.9996，線性范圍為0.042 ～0.846 mg/mL。

圖2 去乙酰車葉草苷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液20 μL，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷峰面積的RSD分別為0.78%、0.67%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷峰面積的RSD分別為0.63%，0.76%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批梔子粉末，平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷的平均含量，其 RSD值分別為0.98%、1.16%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量梔子藥材粉末6份，每份約0.25 g，按供試品溶液制備方法，分別制成供試液。分別精密稱定去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷適量制成濃度為0.132 mg/mL、0.338 mg/mL的對(duì)照品溶液，將去乙酰車葉草苷酸甲酯對(duì)照品稀釋10倍，分別取對(duì)照品溶液1 mL，供試液1 mL混合均勻，依法測(cè)定兩種成分的含量，結(jié)果表明去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷的平均回收率(n=6)分別為97.07%(RSD=1.48%)，100.51%(RSD=1.29%)。

2.10 樣品測(cè)定 分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，按上述條件測(cè)定其峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算兩種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 梔子中兩種成分測(cè)定結(jié)果

3 討論

很多文獻(xiàn)［5－6］報(bào)道多是單獨(dú)測(cè)定梔子藥材中梔子苷的含量，作為梔子質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)，但隨著研究的深入，不斷有新的藥理活性被發(fā)現(xiàn)，而活性成分不僅只有梔子苷，吸收入血的有效成分還有去乙酰車葉草苷酸甲酯、山梔苷甲酯等，因?yàn)檫@些成分含量較低，含量測(cè)定存在一定的困難，我們建立了同時(shí)測(cè)定梔子中去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷含量的方法，為梔子資源的充分利用提供科學(xué)依據(jù)。

提取方法的選擇，針對(duì)不同的提取方法(超聲、回流提取)，不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水)，不同提取時(shí)間(15 min、20 min、30 min、45 min、60 min)進(jìn)行考察，最終選擇50%甲醇超聲提取30min可提取完全，與長(zhǎng)時(shí)間提取結(jié)果相差較小。

流動(dòng)相的選擇，實(shí)驗(yàn)中用的流動(dòng)相有乙腈－水，乙腈－0.1%磷酸水溶液，甲醇－水，甲醇－0.1%磷酸水溶液等，《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部梔子含量測(cè)定采用乙腈－水(15∶85)［7］作為流動(dòng)相，經(jīng)考察最終采用乙腈－0.1%磷酸水溶液梯度洗脫可使兩種成分與相鄰峰分離度均大于1.5，峰形較好。

［1］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006:2240－2243.

［2］Junsheng Tian，Yuanlu Cui，Limin Hu，et al.Antidepressant－ like effect of genipin in mice［J］.Neurosci.Lett，2010，479:236 －239.

［3］Yang Yu，Zuolei Xie，Weiwei Ma，et al.Bioactive Iridoid Glucosides from the Fruit of Gardenia jasminoides［J］.Nat.Prod，2009，72:1459–1464.

［4］Quanjun Yang，Bin Wu，Yujing Shi，et al.Bioactivity － guided Fractionation and Analysis of Compounds with Anti－influenza Virus Activity from Gardenia jasminoides Ellis［J］.Arch Pharm Res，2012，35:9 －17.

［5］黃青萍.高效液相法測(cè)定不同產(chǎn)地梔子中梔子甙的含量報(bào)道［J］.醫(yī)學(xué)信息，2008，21(9):1706－1707.

［6］段起，莊義修，陳華師.高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地梔子中梔子苷含量［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5(6):20－21.

［7］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:173.