許曉潔， 王 偉， 王玉華*

(1．內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010110;2．內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古呼和浩特010020)

蒙成藥“巴特日七味丸”收載在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》［1］(蒙藥分冊(cè))第79頁，處方由草烏葉、訶子、茜草、多葉棘豆、黑蕓香、人工麝香、銀朱等七味藥材組成。在對(duì)巴特日七味丸質(zhì)量控制方法的研究過程中，參照《中國藥典》2010年版［2］制草烏項(xiàng)下方法對(duì)草烏葉中雙酯型生物堿的測(cè)定方法進(jìn)行了研究，因生物堿的量太低，未能建立定量測(cè)定方法;參考文獻(xiàn)報(bào)道［3］，采用HPLC法對(duì)訶子進(jìn)行定量測(cè)定方法的研究，因共存成分的干擾大，未能建立測(cè)定方法;黑蕓香是蒙醫(yī)用藥材，缺少化學(xué)成分的研究工作基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)用HPLC法測(cè)定了茜草中大葉茜草素的量;用容量法測(cè)定了銀朱中HgS的量。本研究對(duì)巴特日七味丸的質(zhì)量控制具有意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 雙光束紫外可見分光光度計(jì)TU—1901(上海精科實(shí)驗(yàn)有限公司);高效液相色譜儀P230(大連伊利特分析儀器有限公司);電子天平AL204(梅特勒-托利多儀器有限公司);超聲清洗儀AS3120(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 試藥 巴特日七味丸 (內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，批號(hào)100619;內(nèi)蒙古烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號(hào)090401、091114、100416;內(nèi)蒙古庫倫蒙藥廠，批號(hào)100804;內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)有限公司，批號(hào)10454007、10454009)。

大葉茜草素對(duì)照品 (由中國藥品生物制品檢定所購入，批號(hào)為110884-200604);銀朱 (由烏蘭浩特中蒙制藥有限公司提供);甲醇為色譜純，水為高純水，所用其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法測(cè)定大葉茜草素［4-5］茜草是巴特日七味丸的主要藥味之一。茜草的主要化學(xué)成分為大葉茜草素、羥基茜草素等。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法對(duì)大葉茜草素的測(cè)定方法進(jìn)行了研究。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究確定了提取條件和液相分離條件，并對(duì)HPLC法進(jìn)行了方法學(xué)考察。該方法專屬性和準(zhǔn)確性好，可以作為巴特日七味丸質(zhì)量控制的方法。

2.1.1 色譜條件 C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水 (85∶15);體積流量為1.0 mL/min;檢測(cè)波長為250 nm，進(jìn)樣體積為20 μL。理論塔板數(shù)以大葉茜草素峰計(jì)算不低于4 000。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 供試品溶液的制備 依據(jù)《中國藥典》2010年版“茜草”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素篩選確定了供試品溶液的制備方法。

取本品粉末約4.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，暗處放置5～8 h，超聲處理 (功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状?25%鹽酸 (4∶1)混合溶液20 mL溶解，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，加入三乙胺3 mL，混勻，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取大葉茜草素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含50μg的溶液，即得。

2.1.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按照處方比例及制備工藝，取缺茜草的6味藥材粉末制備陰性對(duì)照品。精密稱取陰性對(duì)照品適量，按2.1.2.1項(xiàng)“供試品溶液的制備”方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取大葉茜草素對(duì)照品，用甲醇溶解并制成每1 mL含有大葉茜草素116.5μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液適量，加甲醇制成含大葉茜草素質(zhì)量濃度為 11.65、23.30、34.95、46.60、58.25、69.90、116.5μg/mL等7組系列對(duì)照品溶液，分別精密吸取系列對(duì)照品溶液20μL，按“色譜條件”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄各圖譜的大葉茜草素峰面積積分值。以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸分析。結(jié)果顯示，大葉茜草素在0.233～2.33μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性，回歸方程為 Y=6 300.6X －267.53(r=0.997 8)。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取本品，按2.1.2.1項(xiàng)方法制備溶液，按2.1.1項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜峰的積分值。6次測(cè)定結(jié)果的RSD為0.45%。

取對(duì)照品溶液，同法測(cè)定并記錄色譜峰的積分值。6次測(cè)定結(jié)果的RSD為0.95%。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品，按2.1.2.1項(xiàng)方法制備溶液，按2.1.1項(xiàng)下方法操作，于溶液制備后的0、0.5、1、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。條件:在棕色瓶中避光放置。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品 (內(nèi)蒙古烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號(hào):090401)6份，按2.1.2.1項(xiàng)方法制備溶液，按2.1.1項(xiàng)下方法操作，記錄色譜圖，計(jì)算其平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.806 mg/g，RSD為2.00%。

2.1.7 專屬性考察 按2.1.2.3項(xiàng)下方法制備溶液，按2.1.1項(xiàng)下方法操作，記錄供試品溶液、陰性對(duì)照溶液、大葉茜草素對(duì)照品溶液的色譜圖。結(jié)果顯示，在對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的位置上，供試品溶液有色譜峰，陰性對(duì)照溶液沒有色譜峰，方法的專屬性好，見圖1。

圖1 大葉茜草素專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig.1 Chromatograms of specificity tests of rubimaillin

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含有量的巴特日七味丸樣品 (內(nèi)蒙古烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號(hào)為090401，含有量為0.806 mg/g)，稱取9份，每份分別加入一定量大葉茜草素對(duì)照品，使之成為80%、100%和120%的加樣回收試驗(yàn)樣品，按2.1.2.1項(xiàng)方法制備溶液，按2.1.1項(xiàng)下方法操作，記錄色譜圖。加樣回收試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1的結(jié)果顯示，80%、100%、120%回收試驗(yàn)結(jié)果的均值為99.0%，RSD為1.61%，表明方法的準(zhǔn)確度好。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

2.2 銀朱中HgS的測(cè)定 礦物藥銀朱在巴特日七味丸的制備過程中，部分入藥，部分用于包衣，投料的比例相對(duì)較大。銀朱藥用時(shí)主要有安神、消炎、鎮(zhèn)靜催眠功效。銀朱中汞的存在形式除硫化汞外，還有游離汞和可溶性汞鹽。游離汞是0價(jià)汞，可溶性汞鹽是指能溶于胃酸的汞鹽。游離汞和可溶性汞鹽經(jīng)一定的腸道細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化后，可能與帶甲基的物質(zhì)反應(yīng)形成甲基汞。人對(duì)甲基汞的吸收率可高達(dá)100%，甲基汞的毒性大［6］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)銀朱中硫化汞的定量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，通過對(duì)硫化汞的質(zhì)量控制使游離汞和可溶性汞鹽的量得到相對(duì)控制，保證用藥的安全和有效。本實(shí)驗(yàn)采用硫氰酸銨滴定法測(cè)定硫化汞 (HgS)［7-8］。

2.2.1 測(cè)定方法 銀朱主含硫化汞 (HgS)。參照《中國藥典》2010年版一部“朱砂”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，用硫氰酸銨滴定法測(cè)定硫化汞量。

取巴特日七味丸，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，置250 mL凱氏燒瓶中，加硝酸50 mL，凱氏燒瓶上加漏斗，加熱使硝酸呈微沸2 h，放冷，濾過，濾渣及濾紙轉(zhuǎn)入原凱氏燒瓶中，加硝酸鉀2.0 g，硫酸20 mL，加熱微沸處理30 min，放冷，加硝酸鉀2.0 g，加熱微沸處理30 min使銀朱完全溶解，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中，用水50 mL分次洗滌燒瓶，洗液并入溶液中，加1%高錳酸鉀溶液至顯粉紅色，2 min內(nèi)不退色，再滴加2%硫酸亞鐵溶液至紅色消失后，加硫酸鐵銨指示液2 mL，用硫氰酸銨滴定液 (0.1 moL/L)滴定至溶液顯淺橙黃色，每1 mL硫氰酸銨滴定液相當(dāng)于11.63 mg的硫化汞。

2.2.2 銀朱藥材的測(cè)定 取銀朱藥材3份，各約0.1 g，精密稱定，同上方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得平均含有量為91.75%。

2.2.3 陰性對(duì)照試驗(yàn) 按處方制備陰性對(duì)照品(缺銀朱)，稱取2份，每份約1.5 g，同上方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，滴加半滴硫氰酸銨滴定液(0.1 mol/L)即顯示到達(dá)滴定終點(diǎn)，并且試驗(yàn)現(xiàn)象明顯，說明處方中的其他組分對(duì)銀朱的測(cè)定沒有干擾。

2.3 樣品測(cè)定 取不同廠家、不同批次的供試品，按2.1.2.1項(xiàng)方法制備溶液，按2.1.1項(xiàng)下方法操作，記錄色譜圖，計(jì)算巴特日七味丸中大葉茜草素量，按2.2.1項(xiàng)測(cè)定7個(gè)批次巴特日七味丸中硫化汞的量，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.2 Results of content determination of samples(n=3)

結(jié)果顯示，不同來源的樣品以及同一來源的不同批次樣品中大葉茜草素的量有變化，在0.530 mg/g～0.819 mg/g之間。巴特日七味丸中含銀朱以硫化汞計(jì)，含有量在27.18～45.23 mg/g之間。銀朱藥材含有毒成分游離汞和可溶性汞鹽，通過對(duì)硫化汞的定量測(cè)定和控制可以使游離汞和可溶性汞鹽得到相對(duì)控制。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)巴特日七味丸的安全有效用藥具有意義。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 按2.1.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，對(duì)以下3種流動(dòng)相進(jìn)行了比較研究［9-10］:甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液 (25 ∶50 ∶25)、甲醇-乙腈-水 (6∶3∶1)和甲醇-水 (85∶15)。結(jié)果表明，以甲醇-水 (85∶15)作為流動(dòng)相時(shí)，大葉茜草素峰的保留時(shí)間為20.2 min，且與相鄰組分峰分離效果好。

3.2 檢測(cè)波長的選擇 在200～800 nm范圍內(nèi)對(duì)大葉茜草素進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示，大葉茜草素在218.00、250.00、273.00、281.50、392.00 nm 處有吸收。分別將巴特日七味丸供試品溶液和大葉茜草素對(duì)照品溶液20μL注入高效液相色譜儀，對(duì)紫外檢測(cè)器設(shè)定不同檢測(cè)波長［11］的情況下，對(duì)大葉茜草素峰進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算巴特日七味丸中大葉茜草素的量。結(jié)果表明，在250 nm波長處，大葉茜草素量最高，故確定250 nm作為檢測(cè)波長，與《中國藥典》2010年版一部茜草項(xiàng)下的檢測(cè)波長一致。

3.3 對(duì)大葉茜草素和大葉茜草素溶液的穩(wěn)定性考察 大葉茜草素在常溫不避光的條件下穩(wěn)定性差，在薄層色譜中可顯示兩個(gè)斑點(diǎn)。用HPLC法考察大葉茜草素甲醇溶液的穩(wěn)定性，常溫不避光條件下的穩(wěn)定時(shí)間約為6 h［12］，避光冷藏，該時(shí)間可延長到4倍以上，因此，建議將大葉茜草素對(duì)照品及溶液避光冷藏。

3.4 提取溶劑和提取時(shí)間的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用《中國藥典》2010年版一部的茜草項(xiàng)下的提取方法，即超聲提取。對(duì)甲醇、乙醇和80%甲醇作為溶劑的結(jié)果進(jìn)行了比較研究，結(jié)果顯示，用甲醇作為溶劑時(shí)的提取效率最高。

對(duì)超聲時(shí)間15、30、45、60 min的結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，從15 min到30 min，隨著提取時(shí)間的延長，提取效率增加;30 min以后，提取時(shí)間的延長使含有量有下降趨勢(shì)。故將超聲時(shí)間確定為30 min。

3.5 浸泡時(shí)間的選擇 本實(shí)驗(yàn)對(duì)《中國藥典》2010年一部版茜草含量測(cè)定項(xiàng)下的超聲提取前的浸泡時(shí)間進(jìn)行了篩選。設(shè)置不同的浸泡時(shí)間，考察浸泡時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

結(jié)果顯示，浸泡時(shí)間在0～5 h范圍內(nèi)，隨浸泡時(shí)間增加，大葉茜草素含有量逐漸增大;浸泡5～8 h之間，大葉茜草素量最高;浸泡時(shí)間大于8 h后，大葉茜草素量有下降趨勢(shì)，可能與大葉茜草素在甲醇溶液中的穩(wěn)定性有關(guān)，故將浸泡時(shí)間規(guī)定為5～8 h。

3.6 耐用性試驗(yàn) 取本品，按2.1.2.1項(xiàng)方法制備溶液，按2.1.1項(xiàng)下方法操作，記錄色譜圖。用兩個(gè)型號(hào)的色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果見表3。

表3 不同色譜柱的試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of different columns

結(jié)果顯示，Phenomenex C18柱的峰窄而高，Diamonsil C18柱的峰寬且矮，兩種柱子均能達(dá)到與相臨峰的基線分離，按大葉茜草素的峰計(jì)算理論塔板數(shù)均大于10 000，兩個(gè)柱子的測(cè)定結(jié)果基本一致。故實(shí)驗(yàn)對(duì)柱子的型號(hào)不做要求。

3.7 峰純度檢查 按2.1.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液。按2.1.1項(xiàng)下方法操作，僅對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行調(diào)整，分別用如下的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，甲醇-水 (85∶15)、甲醇-水 (80∶20)、甲醇-水 (78∶22)。各流動(dòng)相的色譜圖顯示，隨著流動(dòng)相極性增大，大葉茜草素色譜峰的保留時(shí)間增加，但供試品溶液的主峰面積沒有出現(xiàn)裂分現(xiàn)象。

進(jìn)一步用高效液相色譜儀的二極管陣列檢測(cè)器對(duì)被測(cè)成分大葉茜草素的峰進(jìn)行純度驗(yàn)證，結(jié)果表明，被測(cè)供試品溶液中大葉茜草素峰純度為98.49%。

3.8 硝酸加熱溶解時(shí)間的考察 為了保證有機(jī)破壞過程進(jìn)行完全，對(duì)硝酸用量和加熱溶解時(shí)間作了考察。取供試品約1.5 g，加50 mL硝酸，置凱氏燒瓶中，為避免加熱過程中硝酸分解逸出過快，于凱氏燒瓶口處放一漏斗，置電爐上加熱保持微沸，分別對(duì)15、30、60、90、120、150、180 min的加熱時(shí)間的結(jié)果進(jìn)行觀察和比較。結(jié)果顯示，加熱時(shí)間從90 min開始，凱氏燒瓶中的棕色煙霧逐漸消失，溶液的顏色逐漸變淺;加熱至120 min時(shí)，凱氏燒瓶中的棕色煙霧完全消失，溶液變得幾乎無色透明;加熱時(shí)間進(jìn)一步延長時(shí)，觀察的結(jié)果與120 min相同。故將加熱時(shí)間定為120 min。

3.9 硝酸鉀和硫酸作用時(shí)間、次數(shù)的考察 為保證被測(cè)成分消解完全，對(duì)硝酸鉀加入次數(shù)及硫酸作用時(shí)間進(jìn)行考察，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)觀察，結(jié)果顯示，加入硫酸20 mL，硝酸鉀2.0 g，加熱微沸處理30 min，放冷，加硝酸鉀2.0 g，加熱微沸處理30 min，放冷，溶液接近無色，即消解完全。

［1］衛(wèi)生部藥典委員會(huì)．中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn):蒙藥分冊(cè)［S］．1998:79．

［2］國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:220．

［3］貝玉祥，郭 英，和萬芳，等．訶子中總多酚含量的測(cè)定及其超聲提取工藝的研究［J］．生物技術(shù)，2008.18(2):82-85．

［4］唐宇偉，孫彬賢，黃德杰．參茜固經(jīng)顆粒中大葉茜草素含量測(cè)定［J］．中成藥，2005，27(1):28-29．

［5］索菲婭，王 弘，陳世忠．不同采收期茜草中大葉茜草素含量的動(dòng)態(tài)研究［J］．中成藥，2006，28(10):1499-1501．

［6］周超凡，林育華．傳統(tǒng)中藥朱砂應(yīng)用概況及其安全性［J］．藥物不良反應(yīng)雜志，2008，10(3):184-189．

［7］王東平，魏立新，杜玉枝，等．藏藥“佐太”中硫化汞含量測(cè)定的方法學(xué)考察［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21(6):1359-1363．

［8］陳 燕，易進(jìn)海，劉玉紅，等．二十五味珊瑚丸中酯型生物堿和硫化汞的含量測(cè)定［J］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，3(16):44-47．

［9］薛 麗，陳世忠，索菲婭，等．HPLC法測(cè)定茜草飲片中大葉茜草素的含量［J］．藥物分析雜志，2009，29(3):363-365．

［10］郭桂明，蔡 樂，梁小雨，等．HPLC法測(cè)定茜草飲片中大葉茜草素和羥基茜草素的含量［J］．北京中醫(yī)藥，2011，30(7):541-542．

［11］張 寧，楊曉宏，馬曉帆．HPLC法測(cè)定十三味菥蓂膠囊中大葉茜草素的含量［J］．藥物分析雜志，2007，27(9):1475-1477．

［12］劉 廣，齊 娜，徐本明．大葉茜草素在甲醇溶液中的穩(wěn)定性研究［J］．華西藥學(xué)雜志，2010，25(3):320-322．