杜玉然， 賀福元，2*， 鄧俊林， 雷 虹， 包小燕， 謝相貴

(1．湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南長沙410208;2．中藥藥性與藥效國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室，湖南長沙410208)

中藥材在自然界空氣、水、無機鹽、陽光等生物環(huán)境因素的影響下，經(jīng)過漫長的生物進化形成了穩(wěn)定的物種，具有遺傳多態(tài)性［1］。其生長發(fā)育可看成為在初生、次生代謝酶體系特別是CYP450家族酶的作用下，將初生態(tài)外源性成分有序生化代謝成次生態(tài)內(nèi)源性成分的綜合過程。因此中藥材作為多成分的有機整體其成分間具有同母核群生性的特點［2］。紅花藥材在全國多省份均有生產(chǎn)，由于地理環(huán)境因素的影響，微觀狀態(tài)為母核衍化的群生化合物種類及含有量不同，宏觀表現(xiàn)為紅花質(zhì)量的參差不齊，這就給紅花藥材建立完整質(zhì)量控制方法提出了難題。

本課題組已提出的“網(wǎng)通虹勢”代謝規(guī)律，即藥材同母核群生性成分間代謝“網(wǎng)通”［3］，可以相互轉(zhuǎn)化，另外根據(jù)生物物理學原理，中藥材生長發(fā)育遵循熱力學守恒定律，成分間化學勢整體維持平衡如虹吸現(xiàn)象 (此消彼長，總量不變)［4］。本研究以“網(wǎng)通虹勢”為原理依據(jù)，針對不同產(chǎn)地紅花藥材，以生物熱力學為理論依據(jù)，創(chuàng)立紅花藥材的熱力學狀態(tài)函數(shù)，研究紅花宏觀狀態(tài)參數(shù)與虹勢性規(guī)律的關(guān)系，為構(gòu)建宏觀狀態(tài)函數(shù)與微觀成分濃度相統(tǒng)一的中藥化學質(zhì)量控制體系提供模型及數(shù)據(jù)參考［5］。

1 原理

本課題組提出中藥材的多態(tài)性與成分的多樣性可用遺傳統(tǒng)計學與理論生物物理學進行研究，建立起微觀成分指紋圖譜信息與宏觀狀態(tài)函數(shù)數(shù)學模型［6］。中藥材成分宏觀質(zhì)量參數(shù)體系包括表觀平衡常數(shù)、燃燒焓、信息熵、信息量、生物熵，其中燃燒焓、信息熵、生物熵及表觀平衡常數(shù)反映中藥材不同遺傳狀態(tài)的性質(zhì)參數(shù)，而信息量反映其量變的程度參數(shù)。公式推導詳見本課題組文獻［7］，應(yīng)用公式列舉如下:在初生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定的條件下，表觀平衡常數(shù)K'為K'=，式中ai為次生態(tài)i成分濃度，初生態(tài)s成分濃度。信息熵Sie為Sie=其中C為常數(shù)。信息量Siq為Siq為特征峰的總面積，W0為對應(yīng)的總質(zhì)量。生物熵

2 實驗材料及方法

2.1 儀器與試藥

2.1.1 儀器 電子天平CP114(上海奧豪斯儀器有限公司)，SK2200HP型數(shù)控超聲儀 (上?？茖С晝x器有限公司)，HH—4智能數(shù)顯恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司)，DRF—6050型真空干燥箱 (上海精宏實驗設(shè)備有限公司);安捷倫高效液相色譜儀，Agilent 1200色譜分析工作站，Agilent UV檢測器，Agilent自動進樣器。

2.1.2 試藥 羥基紅花黃色素A對照品購自中國藥品生物制品檢定所 (批號111637～200905，供含量測定用，規(guī)格20 mg)。13份不同產(chǎn)地紅花藥材分別來自S1四川、S2內(nèi)蒙古、S3江西、S4云南、S5浙江、S6安徽、S7吉林、S8山西、S9河北、S10廣西、S11新疆、S12河南、S13西藏，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學藥學院周日寶老師鑒定為菊科Carthamus tinctorius L．的干燥花。用60℃真空干燥箱干燥，備用。超純水 (實驗室自制)，乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑為分析純。

2.2 紅花水溶性浸出物指紋圖譜的建立［8］參考2010年版《中國藥典》一部附錄ⅩA記載水溶性浸出物冷浸法測定。

2.2.1 羥基紅花黃色素A對照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品適量制備成0.625 mg/mL的溶液，加入超純水超聲溶解，定容至2 mL量瓶，即為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別稱取不同省份的紅花供試藥材10 g分別置于13個500 mL三角錐形燒瓶中，分別量取250 mL蒸餾水浸潤30 min，85℃水浴浸提30 min，趁熱抽濾，再分別加入250 mL蒸餾水85℃水浴浸提30 min，抽濾，合并兩次濾液，得到13份不同產(chǎn)地紅花水提液。分別取2 mL不同產(chǎn)地的紅花水提液，用0.45μm微孔濾膜過濾至自動進樣瓶，供測定指紋圖譜使用。其他水提液分別水浴濃縮，真空干燥，得13份干燥樣品，供測定燃燒焓使用。

2.2.3 色譜條件 UtimateTM AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5μm);柱溫30℃;流動相為0.2%磷酸-乙腈梯度洗脫，0 min(97∶3)→12 min(90∶10)→32 min(84∶16)→62 min(73∶27)→70 min(97∶3);體積流量1 mL/min(12 min為0.8 mL/min);進樣量10μL。檢測條件:Agilent 1200高效液相色譜儀 (包括G1311A四元泵、G1314B可變波長檢測器、G1329A自動控溫的自動進樣器、Agilent LC色譜工作站)。

圖1 紅花水提物HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of water extracts from Carthamus tinctorius

2.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 按上述色譜條件對供試品溶液、對照品溶液以及超純水空白液進行測定，記錄色譜圖，如圖1。理論塔板數(shù)按羥基紅花黃色素計算均不低于3 000，分離度均大于1.0。陰性對照品圖中無干擾峰存在。在0.125～12.5μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，儀器的精密度良好，樣品在30℃條件下24 h基本穩(wěn)定，樣品制備方法具有可重復操作性。

2.2.5 全國13產(chǎn)地指紋圖譜的建立 按上述色譜條件對各樣品進針，得到指紋圖譜，見圖2。

圖2 全國13產(chǎn)地紅花水提物HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint chromatogram of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

2.3 燃燒焓的測定［9］在測量儀器的內(nèi)筒中準確加入3 000 mL蒸餾水。精密稱取標準物苯甲酸2片 (共1.001 6 g)置于燃燒皿中，將燃燒皿放于氧彈中，取約6 cm長鎳鉻絲安裝好 (注意鎳鉻絲不能與燃燒皿接觸可與藥物接觸)，擰緊氧彈。在3.0 MPa下向氧彈中充入足夠氧氣，安裝好電極，置于內(nèi)筒蒸餾水中，檢查無漏氣后，放好桶蓋點火，開始記錄顯示器上溫度的變化 (溫度上升)，待溫度首次下降為終點停止記錄。終點完成時仔細觀察彈筒和燃燒皿無殘留，保證燃燒完全［10］。若有不完全跡象，稱出未燃燒完的鎳鉻絲質(zhì)量，經(jīng)溫度矯正計算標準熱容量 (詳細參考HR3000數(shù)顯熱量計使用說明)。同樣方法連續(xù)測定3次，計算得標準熱容量為140 561.267 1 J/K，溫度升高相對標準差 (relative standard deviation，RSD)小于2.00%，說明儀器精密度好。藥物提取物預(yù)先干燥，準確稱定1.0 g于燃燒皿中，具體操作方法同標準苯甲酸熱焓測定，計算公式如下:

上述公式中ΔT、T校正均為溫度，單位為℃，ΔT試驗中測得，T校正按0.005 3計算，Q點火絲按120 J計算，M為實驗所稱量樣品質(zhì)量，單位為g。

3 結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

3.1 紅花水提物的燃燒焓 按2.3項測得溫度差，代入公式求得，見表1。

表1 全國13產(chǎn)地紅花水提物燃燒焓Tab.1 Combustion enthalpies of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

由表1可知，全國13產(chǎn)地購置的紅花水提物的燃燒焓均在－14 861與－16 006 J/g范圍內(nèi)，其RSD為2.235%，說明13產(chǎn)地紅花水提物燃燒焓穩(wěn)定，在能量守恒定律基礎(chǔ)上，各地紅花宏觀生物熱基本一致。

3.2 全國13產(chǎn)地紅花水提物樣品液指紋圖譜數(shù)據(jù)分析

3.2.1 全國13產(chǎn)地紅花指紋圖譜總量統(tǒng)計矩參數(shù)［11］參考本課題組原積分條件［8］，最小半峰寬0.20 min、最小峰面積15 000μV/s、最小峰高1 000μV，13產(chǎn)地紅花指紋圖譜得到總量統(tǒng)計矩參數(shù)見表2。

表2 全國13產(chǎn)地紅花水提物總量統(tǒng)計矩參數(shù)Tab.2 Total quantum statistical parameter of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

3.2.2 全國13產(chǎn)地紅花指紋圖譜相似度 按中國藥典委員會推薦的中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版計算得指紋圖譜的相似度，見表3。

表2與表3數(shù)據(jù)分析，總量統(tǒng)計矩參數(shù)及相似度可以反映不同產(chǎn)地紅花的穩(wěn)定性與差異性。總量統(tǒng)計矩參數(shù)是對紅花指紋圖譜微觀信息的體現(xiàn)，零階矩AUCT為指紋圖譜峰面積之和，13產(chǎn)地AUCT的RSD為22.74%，說明不同產(chǎn)地紅花質(zhì)量存在差異性。相似度范圍為0.037～0.962，其中相似度小于0.5的占38.20%，再次證明不同產(chǎn)地紅花指紋圖譜微觀表征具有差異性，群體不穩(wěn)定，全國13產(chǎn)地的紅花藥材質(zhì)量參差不齊。

表3 全國13產(chǎn)地紅花水提物指紋圖譜相似度Tab.3 Fingerprint chromatogram's sim ilarity of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

3.2.3 全國13產(chǎn)地紅花指紋圖譜信息熵、信息量及混雜平衡常數(shù)全指紋圖譜結(jié)果見表4，24特征峰成分結(jié)果見表5。

表4 全國13產(chǎn)地紅花水提物信息熵 (量)、生物熵及表觀平衡常數(shù)Tab.4 In formation entropies(capabilities)，bio-entropies and apparent equilibrium constants of water extracts of Carthamus tinctorius from the national 13 provinces

表4～表5數(shù)據(jù)分析一，全指紋圖譜信息熵范圍 (3.934～5.783)，其 RSD為8.35%，24特征峰的信息熵范圍 (3.316～4.373)，其 RSD為6.18%，說明全國13產(chǎn)地紅花藥材信息熵相對穩(wěn)定，單位成分的混雜度小。

全指紋圖譜信息量波動范圍較大(7.793×107～3.195 ×108μV·s/g)，其 RSD 為 38.02%;24成分的信息量(6.569×107～1.599×108μV·s/g)，其RSD為23.56%。上述數(shù)據(jù)說明全國13產(chǎn)地紅花水提物的信息量是不穩(wěn)定的，即指紋圖譜具有較高的混雜靈敏度，受到某方面影響后極易表現(xiàn)出信息熵的不穩(wěn)定，出現(xiàn)較高的混雜度。故信息熵可用于生物熵的計算，而信息量不能用于生物熵［12］的計算，可用作指紋圖譜的分析。

表4～表5數(shù)據(jù)分析二，全指紋圖譜生物熵均在－83.46～－147.9 J/K之間，RSD為－14.36%。特征峰生物熵波動范圍在－63.02與－79.8 J/K之間，其RSD為－6.208%。整體看來紅花水提物的生物熵具有穩(wěn)定性，宏觀質(zhì)量表征穩(wěn)定。特征峰生物熵的穩(wěn)定性優(yōu)于全指紋圖譜。表觀平衡常數(shù)全指紋圖譜算得0.033 8～0.103 4，其RSD為32.65%;24特征峰指紋圖譜的表觀平衡常數(shù)0.048 3～0.100 4，其RSD為21.25%。上述數(shù)據(jù)說明全國各地紅花水提物的表觀平衡常數(shù)不同，不同地方的氣候不同，產(chǎn)生各成分的種類不同。

4 討論

中藥指紋圖譜作為中藥多成分質(zhì)量控制分析體系，只能對微觀成分量變進行簡單描述，具有一定的局限性。因此從原植物生物學屬性角度結(jié)合紅花指紋圖譜探討紅花各成分的動態(tài)穩(wěn)定性，在原有的指紋圖譜信息的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)變?yōu)樾畔㈧睾托畔⒘?。再結(jié)合信息熵與平衡常數(shù)，平衡常數(shù)與Gibbs自由能的關(guān)系，建立起生物熱焓、生物熵的紅花多成分宏觀質(zhì)量控制狀態(tài)函數(shù)模型，其能夠全面準確地揭示紅花質(zhì)量動態(tài)變化規(guī)律，為中藥質(zhì)量控制提供參考。

表5 全國13產(chǎn)地紅花水提物24特征峰燃燒焓、信息熵 (量)、生物熵及表觀平衡常數(shù)Tab.5 Combustion enthalpies，information entropies(capabilities)，bio-entropies and apparent equilibrium constants of water extracts＇24 characteristic peaks of Carthamus tinctorius from the national 13 p rovinces

4.1 峰面積與燃燒焓方差分析 燃燒焓是紅花生物能熱量的宏觀狀態(tài)表征，指紋圖譜是紅花各成分群的微觀含量表征。各按SPSS 16.0操作，將燃燒焓 (因變量)與24個特征峰 (自變量)經(jīng)方差分析，F(xiàn)=11.765，P=0.002線性回歸模型有統(tǒng)計學意義。說明各特征峰燃燒焓具有疊加性，可通過疊加計算總?cè)紵?，宏觀與微觀具有統(tǒng)計學意義。

4.2 全指紋圖譜與特征峰的比較 紅花指紋圖譜的特征峰可看做是紅花主要成分群。比較表4與表5數(shù)據(jù)，可得全成分信息熵、信息量、生物熵及表觀平衡常數(shù)的RSD均大于主成分群，說明主成分群的穩(wěn)定性更高，且混雜靈敏度小，不易出現(xiàn)混雜現(xiàn)象。生物熵更加穩(wěn)定，全國紅花主成分宏觀質(zhì)量表征具有共通性。整體體現(xiàn)了全國13產(chǎn)地紅花藥材主成分的相似性，全成分的差異性。猜想不同產(chǎn)地紅花基礎(chǔ)藥效相同，可能與主成分穩(wěn)定相關(guān);不同產(chǎn)地紅花又有優(yōu)劣之分，可能與全成分種類、含量差異有關(guān)。

綜上所述，紅花中藥材的水提物有穩(wěn)定的燃燒焓、信息熵及生物熵，宏觀狀態(tài)穩(wěn)定。不同產(chǎn)地紅花其指紋圖譜微觀表征具有差異性，多成分之間代謝體現(xiàn)“虹勢性”，不同地方的信息量、表觀平衡常數(shù)體現(xiàn)“道地性”。虹勢性體現(xiàn)了藥材中各成分之間的轉(zhuǎn)化是控制宏觀的藥材代謝作用方向，道地性體現(xiàn)了在宏觀作用下調(diào)節(jié)的精確作用。因此中藥成分質(zhì)量是微觀各成分質(zhì)量與宏觀成分群組合模式質(zhì)量的統(tǒng)一。

本實驗根據(jù)遺傳多態(tài)性、生物物理學燃燒焓原理，結(jié)合現(xiàn)有的指紋圖譜質(zhì)量評估方法，首次建立紅花的信息熵、信息量、生物熵及表觀平衡常數(shù)數(shù)學模型，為本課題組“網(wǎng)通虹勢”理論提供實例支持，為紅花質(zhì)量控制注入新的數(shù)學理念。

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