劉蘭慶汪鋆植,2鄧改改,2李平媛,2邊宇,2聶淞瑩,2柳杰,2程凡,2

(1.三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室,湖北 宜昌443002；2.湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心,湖北宜昌443002)

湖北海棠[Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.]為薔薇科蘋果屬植物,其嫩葉作為茶葉飲用已有千年歷史.衛(wèi)生部2014年第20號公告批準湖北海棠(茶海棠)葉為新食品原料.同時,湖北海棠也是土家族常用藥,收載于《湖北省中藥材質(zhì)量標準》[1].研究表明湖北海棠具有抗氧化、保肝、降血糖、抗病毒等多種藥理作用[1-2],有良好的研究利用價值.有學(xué)者認為土家族“藥王昏死茶露醒”傳說中的茶露即為湖北海棠葉上的露水[3-4].該傳說明確指出茶露能解“烏頭”之毒,有研究表明,富含黃酮類化合物的中藥具有減輕烏頭毒性的作用[5].湖北海棠富含黃酮類化合物,對酒精、CCl4等肝損傷有保護作用[6-7].因此,本文探討湖北海棠對烏頭毒性的影響,為合理利用湖北海棠提供依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

湖北海棠葉,烏頭塊根均采于湖北省長陽土家族自治縣,經(jīng)三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院王玉兵博士鑒定原植物為湖北海棠[Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.]、烏頭(Aconitum carmichaeli Debx.)；烏頭堿對照品購自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院(批號MUST-11031101,HPLC 鑒定其純度≥99%)；LDH檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號20191015)；硫酸阿托品注射液為天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司生產(chǎn)(國藥準字H41021256)；乙腈、甲醇為色譜級,純水為去離子重蒸水,其他試劑均為分析純.

1.2 主要儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀(日本島津)；色譜柱UItimate XB-C18(5μm,4.5 mm×250 mm)；L-530型臺式低速離心機(湖南湘儀公司)；CP225D 型電子天平(Sartorius公司)；SW-CJ-2ED 超凈工作臺(天津市泰斯特儀器有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國SHELLJB公司).

1.3 動物

昆明小鼠(三峽大學(xué)動物實驗中心提供),雌雄各半,體重20～25 g；SD 大鼠(三峽大學(xué)動物實驗中心提供),雌雄各半,體重220～250 g,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(鄂)2017-0012.飼養(yǎng)于三峽大學(xué)動物中心SPF級動物實驗室,屏障系統(tǒng),飲水、攝食、光照均符合《湖北省實驗動物質(zhì)量控制標準》,實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2017-0061.

2 方法

2.1 湖北海棠、烏頭水提物制備

湖北海棠葉、烏頭塊根粉碎成粗粉,分別取烏頭粗粉15 g、湖北海棠葉粗粉50 g,各加入500 m L水浸泡12 h后,80℃回流提取3次,每次1 h,合并水提液,減壓濃縮,0.22μm濾膜過濾,分別得到含生藥質(zhì)量濃度為15 mg/m L的烏頭水提物、含生藥質(zhì)量濃度為100 mg/m L 的湖北海棠水提物(以下稱海棠水提物).HPLC法測定烏頭水提物中烏頭堿和海棠水提物中根皮苷的含量.

2.2 烏頭、海棠水提物實驗用量選擇

1)取50只小鼠,雌雄各半,分開適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d后,隨機分5組,每組雌雄各10只,取2.1中烏頭水提物,稀釋后按15、30、60、75、100 mg/kg的烏頭水提物,灌胃給藥(0.1 m L/10 g),觀察記錄7 d內(nèi)動物死亡數(shù).

2)取30只小鼠,雌雄各半,分開適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d后,隨機分3組,每組雌雄各10只,取2.1中的海棠水提物,稀釋成3 個劑量組,質(zhì)量分數(shù)分別為400、600、800 mg/kg[5],與2.2.1中60 mg/kg的烏頭水提物,一起灌胃給藥后,觀察記錄7 d內(nèi)動物死亡數(shù).

2.3 海棠水提物給藥方式選擇

2.3.1 中毒后給藥

取20只小鼠,雌雄各半,分開適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d后,隨機分兩組,每組各10 只,先灌服烏頭水提物,1 h后,其中一組灌服海棠水提物,另一組灌服等體積蒸餾水,觀察7 d內(nèi)動物死亡數(shù).

2.3.2 預(yù)防性給藥

取20只小鼠,雌雄各半,分開適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d后,隨機分兩組,每組各10 只,其中一組灌服海棠水提物,另一組灌服等體積蒸餾水.1 h后,兩組均灌服烏頭水提物,觀察7 d內(nèi)動物死亡數(shù).

2.4 海棠水提物對烏頭水提物血藥質(zhì)量濃度的影響

取40只小鼠,雌雄各半,分開適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d后,隨機分4組,每組各10只,按預(yù)防性給藥方式.海棠低、中、高劑量組分別灌服不同濃度海棠水提取,烏頭組灌服等體積蒸餾水.1 h 后,各組均灌服烏頭水提物,20 min后,摘眼球取血,分離血清.測定血清中烏頭堿的血藥質(zhì)量濃度.

2.4.1 對照品溶液的配制

分別精密稱取烏頭堿對照品5.0、2.5、1.3、0.6、0.3 mg于10 m L容量瓶,加甲醇溶解,稀釋至刻度.

2.4.2 樣品溶液的配制

各組小鼠雌雄分別隨機兩只血清等量合并、混勻,再取100μL,加3%高氯酸溶液300μL 超聲提取3次,混勻,渦旋振蕩2 min,4 000 r·min-1離心10 min取上層清液,氮氣吹干,用50μL甲醇溶解,HPLC法檢測烏頭堿濃度.

2.4.3 烏頭堿標準曲線的建立

取2.4.1中的各濃度對照品溶液20μL 注入高效液相色譜儀,測定烏頭堿濃度.測定條件為:色譜柱:UItimate XB-C18(5μm,4.6 mm×250 mm)；流動相∶甲醇∶水(0.1%磷酸0.1%三乙胺)=35∶65；柱溫:25℃；流速:1 m L·min-1；檢測器:DAD；檢測波長:250 nm.計算峰面積,重復(fù)進樣3次,以峰面積值對烏頭堿量做標準曲線.

2.5海棠水提物對烏頭中毒大鼠心電的影響

取大鼠20只,雌雄各半,分開適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d后,隨機分5組,每組各4只.海棠水提物組灌服海棠水提物20 min后,灌服烏頭水提物,阿托品組在灌胃烏頭水提物后腹腔注射阿托品,烏頭組灌服烏頭水提物.各組灌服烏頭水提物后立即麻醉.正常對照組灌服等體積蒸餾水后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,固定.連接BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng),系統(tǒng)穩(wěn)定10 min后,記錄心電圖[8].每組每分鐘內(nèi)取任意3段,計算平均心率.

2.6海棠水提物對烏頭水提物中毒心肌細胞H9c2細胞活力的影響

2.6.1 海棠水提物對烏頭水提物中毒心肌細胞H9c2培養(yǎng)液中烏頭堿質(zhì)量濃度的影響

取對數(shù)生長期H9c2心肌細胞,培養(yǎng)瓶培養(yǎng),模型組和給藥組細胞加入400μg/m L 烏頭水提物,給藥組再分別加入海棠水提物低、中、高劑量(20、40、80 μg/m L),空白組加入等量培養(yǎng)基,培養(yǎng)4 h,取培養(yǎng)液,按2.5.3處理,按2.5.4中的色譜條件進樣,測定各組心肌細胞H9c2培養(yǎng)液中烏頭堿的質(zhì)量濃度.

2.6.2 海棠水提物對烏頭水提物中毒心肌細胞H9c2細胞活力的影響

心肌細胞H9c2加藥處理方式同2.6.1,MTT 方法測定不同質(zhì)量濃度海棠水提物(20、40、80μg/m L)對心肌細胞H9c2細胞活力的影響.

2.6.3 海棠水提物對烏頭水提物中毒心肌細胞H9c2乳酸脫氫酶(LDH)釋放量的影響

取2.6.1心肌細胞培養(yǎng)液100μL,4℃離心10 min(1 000 r/min),取上清液10μL,按試劑盒方法測定.

2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理分析,組間比較采用單因素方差分析,各指標均以表示,以P＜0.05作為有統(tǒng)計意義.

3 結(jié)果與討論

3.1烏頭水提物和海棠水提物代表性成分含量

按2.4.3中色譜條件進樣分析,計算烏頭水提物中烏頭堿的濃度；參考文獻色譜條件進樣分析[7].測得烏頭水提物中烏頭堿的質(zhì)量濃度為0.04 mg/m L；海棠水提物中根皮苷的質(zhì)量濃度為4 mg/m L.

圖1烏頭水提物和湖北海棠水提物HPLC圖

3.2烏頭水提物中毒劑量選擇

通過實驗確定烏頭水提物100%致死量和0%致死量分別相當于原生物100 mg/kg和30 mg/kg.結(jié)果見表1.海棠水提物能降低烏頭水提物中毒的死亡率,結(jié)果見表2.

表1烏頭水提物致小鼠死亡率

表2海棠水提物對小鼠烏頭水提物中毒死亡的影響

烏頭水提物100%致死量使小鼠很快出現(xiàn)蜷縮,嘔吐狀,身體拉長,毛發(fā)濕潤等疼痛表現(xiàn),小鼠出現(xiàn)驚厥、彈跳,最終死亡.烏頭水提物50%致死量引起部分小鼠出現(xiàn)蜷縮,嘔吐狀,身體拉長,最終將近半數(shù)小鼠死亡.另一半3～7 d逐漸恢復(fù)正?；顒雍惋嬍筹嬎?烏頭水提物0%致死量引起部分小鼠出現(xiàn)蜷縮,嘔吐狀,躁動等癥狀,2～5 d逐漸恢復(fù)正?；顒雍惋嬍筹嬎?無死亡.

空白對照組:無中毒癥狀,正常飲食飲水,無死亡.

3.3 給藥次序?qū)π∈鬄躅^水提物中毒死亡的影響

預(yù)防性給藥效果優(yōu)于中毒后給藥,結(jié)合烏頭水提物中毒的100%致死量和0%致死量,選擇先給予不同質(zhì)量濃度的海棠水提物,再給予60 mg/kg烏頭水提物.結(jié)果見表3.

3.4 海棠水提物對烏頭水提物中毒大鼠心率及心肌的影響

表3給藥次序?qū)π∈鬄躅^水提物中毒死亡的影響

海棠水提物能改善烏頭水提物中毒引起的大鼠心率失常.給藥20 min烏頭組出現(xiàn)明顯心率失常,隨著時間的延長,心電圖顯示心肌缺血進行性加重,表現(xiàn)為心電圖Q 波越來越深,R 波丟失.海棠水提物能防治烏頭水提物中毒引起的心率失常,防治烏頭水提物中毒引起的心肌缺血表現(xiàn),心電圖未見明顯心肌缺血改變,70 min后仍未見心電圖出現(xiàn)Q 波及ST-T 等心肌缺血改變心電圖.結(jié)果見表4、圖2.

圖2海棠水提物對烏頭水提物中毒的大鼠心電圖的影響

=4)表4海棠水提物對烏頭水提物中毒的大鼠心率的影響

=4)表4海棠水提物對烏頭水提物中毒的大鼠心率的影響

注：與空白組相比*P＜0.05,**P＜0.01；與烏頭組相比#P＜0.05,##P＜0.01

組別 給藥20 min給藥40 min給藥70 min空白組421.50±32.50##416.29±34.19 425.51±24.5##烏頭(60 mg/kg)278.17±30.84**434.11±25.34 323.5±62.51*海棠低(400 mg/kg)365.54±6.50#*378.21±19.50*391.52±40.54*海棠中(600 mg/kg)463.45±20.34##468.23±29.34 434.65±6.65##海棠高(800 mg/kg)416.29±34.19##438.34±65.53 469.86±91.82##阿托品(0.5 mg/m L)429.63±19.88##431.78±30.12 419.89±20.13##

3.5烏頭堿血藥質(zhì)量濃度的檢測

以烏頭堿對照品溶液的濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,得到標準曲線,對測得的數(shù)據(jù)進行線性回歸分析,擬合方程線性關(guān)系良好,Y=240X+0.774,其相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1.給藥20 min時,各組烏頭堿血藥質(zhì)量濃度見表5.

表5海棠水提物對烏頭堿血藥質(zhì)量濃度的影響s,n=4)

表5海棠水提物對烏頭堿血藥質(zhì)量濃度的影響s,n=4)

注：與烏頭組相比*P＜0.05,**P＜0.01

組別 血藥濃度/(mg·m L-1)烏頭0.523±0.022海棠低0.236±0.003**海棠中0.164±0.007**海棠高0.201±0.054**

海棠中劑量組烏頭堿血藥質(zhì)量濃度僅為烏頭組的30.2%,表明海棠水提物能加快烏頭堿的代謝,不同質(zhì)量濃度的海棠水提物對烏頭堿的代謝有差異,中劑量組較低劑量組和高劑量組的影響明顯.結(jié)果如圖3所示.

3.6海棠水提物對烏頭水提物中毒心肌細胞H9c2細胞活力的影響

3.6.1 海棠水提物對烏頭水提物中毒心肌細胞H9c2培養(yǎng)液中烏頭堿質(zhì)量濃度的影響

按照3.5中的線性回歸方程計算細胞培養(yǎng)液中烏頭堿的質(zhì)量濃度,不同組的烏頭堿的含量差異不顯著.見表6.

表6海棠水提物對H9c2細胞培養(yǎng)液中烏頭堿質(zhì)量濃度的影響s,n=4)

組別 血藥質(zhì)量濃度/(mg·m L-1)烏頭0.029±0.025海棠低0.027±0.032海棠中0.026±0.006海棠高0.025±0.027

3.6.2 海棠水提物對烏頭水提物中毒心肌細胞H9c2細胞活力的影響

MTT 實驗表明400μg/m L 烏頭水提物能顯著降低心肌H9c2細胞活力,不同質(zhì)量濃度海棠水提物對心肌H9c2細胞活力無影響.中高劑量海棠水提物能顯著對抗烏頭水提物對心肌H9c2細胞的影響.結(jié)果見表7.

表7海棠水提物對烏頭水提物中毒H9c2細胞活力的影響,n=3)

表7海棠水提物對烏頭水提物中毒H9c2細胞活力的影響,n=3)

注：與空白組相比*P＜0.05,**P＜0.01；與烏頭組相比#P＜0.05,##P＜0.01

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3.6.3 海棠水提物對烏頭水提物中毒心肌細胞H9c2乳酸脫氫酶(LDH)釋放量的影響

烏頭水提物400μg/m L作用于心肌細胞4 h后,乳酸脫氫酶活力顯著升高,表明細胞膜受損.同烏頭組比,海棠水提物各組乳酸脫氫酶的活力顯著降低.表明海棠水提物對烏頭所至心肌細胞損傷具有保護作用.見表8.

表8海棠水提物對烏頭水提物中毒心肌細胞乳酸脫氫酶的活力的影響

表8海棠水提物對烏頭水提物中毒心肌細胞乳酸脫氫酶的活力的影響

注：與烏頭組相比*P＜0.05,**P＜0.01

組別L LDH值/(U·L-1)空白5.99±0.22**海棠高劑量(80μg/m L)6.07±0.25**烏頭(400μg/m L)12.50±0.45烏頭(400μg/m L)+海棠(20μg/m L)8.73±0.32*烏頭(400μg/m L)+海棠(40μg/m L)7.36±0.28**烏頭(400μg/m L)+海棠(80μg/m L)7.56±0.31**

4 結(jié)論與討論

湖北海棠水提物能有效降低烏頭水提物對心臟的毒性.其作用與增強烏頭中烏頭堿等有毒物質(zhì)代謝及直接保護心肌細胞有關(guān).根皮苷等黃酮類化合物可能是解毒的物質(zhì)基礎(chǔ).

預(yù)先給予海棠水提物死亡明顯減少,海棠水提物(600 mg/kg)能使烏頭水提物的死亡率從50%降到20%.海棠水提物能明顯加強烏頭中毒性物質(zhì)代謝,海棠水提物(600 mg/kg)組烏頭堿血藥質(zhì)量濃度僅為烏頭組的30.2%.烏頭中毒常引發(fā)嚴重的心律失常,海棠水提物能防治烏頭中毒引起的心肌損傷,降低乳酸脫氫酶的活力,逆轉(zhuǎn)Q 波及ST-T 等心肌缺血心電圖的改變,改善心率失常.表明海棠水提物能有效降低烏頭對心臟的毒性.

烏頭是毛茛科烏頭屬植物,以塊根入藥,有川烏、草烏之分.具有良好的鎮(zhèn)痛作用,廣泛應(yīng)用于風濕、關(guān)節(jié)骨病的治療.但如果炮制或服用不當,具有心血管、神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)毒性[9].中毒可引發(fā)各種心律失常,嚴重者出現(xiàn)心室顫動(室顫),甚至死亡,烏頭堿是其中的主要毒性成分.實驗表明湖北海棠水提物能有效降低烏頭對心臟的毒性.一方面可能通過促進肝臟對烏頭堿等毒性物質(zhì)代謝,降低心臟等靶器官中毒性物質(zhì)的濃度,減輕毒性反應(yīng).另一方面改善烏頭中毒引起的心肌缺血、缺氧,直接保護心肌[10].

烏頭中毒無特效解毒藥物,及時救治心律失常是常規(guī)解救方式.湖北海棠水提物能改善烏頭中毒引起的大鼠心肌缺血、心率失?，F(xiàn)象,顯示了良好的解毒作用,表明土家族“藥王昏死茶露醒”傳說中茶露能解“烏頭”之毒這一傳說具有一定的啟源依據(jù),也進一步說明傳說中的茶極有可能為湖北海棠葉.

隨著對烏頭類藥物管理的規(guī)范,烏頭中毒事件越來越少.但心血管疾病卻越來越多,湖北海棠對心肌缺血、缺氧具有良好的保護作用,可進一步研究利用.