吳學志 郭夏麗 胡蔣寧 肖 萍 洪學斌 羅麗萍

(南昌大學生命科學與食品工程學院1，南昌 330031)

(江西省植物資源重點實驗室2，南昌 330031)

樟樹(Cinnamomum camphora)為樟科樟屬中經(jīng)濟價值最大的樹種之一，主要分布在長江以南地區(qū)［1］。傳統(tǒng)醫(yī)學上利用樟樹治療風濕病、扭傷、支氣管炎、肌肉酸痛等疾?。?］。樟樹提取的芳香類精油能夠抑制朽木菌［3］，甚至能夠驅除或殺死昆蟲［4］。樟樹籽含油量可達40%，且其中C10和C12兩種中碳鏈脂肪酸的質量分數(shù)達90%以上［5－6］，由中碳鏈脂肪酸構成的甘油酯可以被用于治療吸收不良綜合癥［7］。我國樟樹資源豐富，但是對樟樹籽卻缺乏合理利用，造成極大浪費，因此，若利用樟樹籽油(Camphor Seed Oil，CSO)生產(chǎn)富含中碳鏈三酰甘油，可使樟樹籽具有良好的應用前景。

二酰甘油(Diacylglycerol，DAG)是一類三酰甘油(Triacylglycerol，TAG)中一個脂肪酸被羥基取代的結構脂質，是天然植物油脂的微量成分及體內(nèi)脂肪代謝的內(nèi)源中間產(chǎn)物，但在自然油脂中產(chǎn)生的量較低。DAG有兩種同分異構體，分別為1，2(2，3)－DAG和1，3 －DAG，由于是 GRAS(Generally Recognized as Safe)物質在日本和美國已被作為食用油［8］。富含DAG的常規(guī)油在味道、外觀、物理性質、功能性等方面都和TAG油相似［9］。在人體內(nèi)，DAG脂肪氧化消耗明顯比TAG快，食用DAG油能夠降低血漿TAG水平和抑制身體脂肪堆積［10－12］，長期食用還能夠抑制肥胖，有利于減肥［13－14］，因此也被作為食品和醫(yī)藥的添加劑［15］。

目前酶法制備DAG的方法有酯化反應［16－17］、甘油解反應［18－19］和水解反應［20］3 種。酯化反應通過游離脂肪酸和去除水的甘油反應生成DAG，此反應得到的DAG純度較高，但所需游離脂肪酸的價格昂貴。甘油解反應是除去TAG的酰基或者使之單甘脂?；?，但在反應過程中難以避免酶顆粒的凝聚，導致反應不充分。水解反應通過水解TAG得到DAG和脂肪酸，雖得到的DAG純度較低，但單甘酯和DAG的分離比DAG和TAG的分離容易，這也為純化DAG提供便利，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

在考慮成本及酶利用有效化的前提下，以CSO為原料，采用固定化脂肪酶催化CSO部分水解，生成富含DAG的CSO(CSO－DAG)。由于酶的價格昂貴且隨著反應的進行，酶活性逐漸降低甚至失活，導致循環(huán)使用次數(shù)減少，成本增加［21］。當反應產(chǎn)物中DAG質量分數(shù)低于40%時，酶被認為已失去使用價值。Mataumoto等［22］發(fā)現(xiàn)不同有機溶劑對lipase PS進行預處理導致酶催化活性提高也不同。故本試驗脂肪酶進行預處理以提高反應次數(shù)。脂肪酶催化CSO水解反應以產(chǎn)物中DAG質量分數(shù)為指標，通過響應面設計選擇最優(yōu)化生產(chǎn)工藝。利用高效液相色譜法－蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC－ELSD)檢測產(chǎn)物中甘油酯的組成。研究結果為樟樹籽油酶法生產(chǎn)中鏈DAG油提供理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

樟樹籽:采自南昌大學校園，新鮮樟樹籽去果皮后晾干備用。

樟樹籽油的制備:熱壓榨法得到的毛油，4 000 r/min離心1 h，收集油層，4%白土吸附20 min脫色，過濾，0.1 MPa的真空條件下，將油吸入脫臭鍋，加熱至160℃，從鍋底部通入少量水蒸汽，持續(xù)升溫至180℃，恒溫脫臭4 h，停止加熱，冷卻降溫至70℃，破真空，放出油脂，過濾，得精煉的 CSO［23－24］。

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM(來自Rhizomucor miehei)和 Lipozyme TL IM(來自Thermomyces lanuginosis)，均由諾維信(中國)生物技術有限公司提供。乙腈和丙酮均為色譜純，其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗儀器

Agilent 1200型液相色譜儀:美國安捷倫公司;Model 300S蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD):法國Sedere公司;SHB－ⅢA循環(huán)水式多用真空泵:河南太康教材儀器廠;RE－52AA旋轉蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;DK－S14型電熱恒溫水浴鍋:上海森信實驗儀器有限公司;SHA－B恒溫振蕩器:廈門精藝興業(yè)科技有限公司;JA1003N精密天平:上海博力儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 HPLC －ELSD 測定甘油酯的組成［20］

甘油酯組成的測定采用HPLC－ELSD法。待測樣品在丙酮中的濃度為1%，經(jīng)0.45 μm微孔有機濾膜過濾后，取 30 μL樣品注入 Nova－Pak C18柱(150 mm ×3.9 mm，4 μm)(美國 Waters公司)中，流動相為丙酮∶已腈 =50∶50(V/V)，流速:1 mL/min，柱溫30℃。ELSD對產(chǎn)物中的脂類進行定性、定量分析。

1.3.2 脂肪酶的選擇

分別稱取5.00 g樟樹籽油于2個15 mL的錐形瓶中，分別加入0.50 g的固定化脂肪酶(Lipozyme RM IM或Lipozyme TL IM)和蒸餾水，放入預熱到反應溫度的恒溫水浴振蕩器中反應3 h，轉速為250 r/min。取出錐形瓶，用定性濾紙過濾除去反應液中的固定化酶，濾液7℃低溫保存待測。

1.3.3 脂肪酶的預處理工藝［25］

分別稱取0.60 g脂肪酶于3個15 mL的錐形瓶中，再分別加入10 mL叔丁醇或丙酮或不加有機溶劑，25℃恒溫水浴2.50 h，抽濾除去溶劑，將脂肪酶加入到5.00 g CSO中浸泡1.50 h，抽濾除去CSO之后，再用有機溶劑浸泡10 min，旋轉蒸發(fā)除去溶劑。然后用處理的酶進行水解反應。

1.3.4 響應面優(yōu)化Lipozyme RM IM水解工藝

本試驗Box－Behnken設計由3個變量組成，3個變量和它們的水平被確定為加酶量(油質量的8% ～12%)、含水量(酶質量的30% ～50%)和溫度(55～75℃)。運用Design Expert 7.1產(chǎn)生17個不同試驗設置確定優(yōu)化條件(表1)。

2 結果與討論

2.1 HPLC－ELSD檢測結果

本試驗水解底物為樟樹籽油，故可以確定產(chǎn)物中僅含油脂類物質。Lee等［26］和汪勇等［27］利用反向HPLC－ELSD測定甘油酯類的出峰順序為脂肪酸類、單甘脂類、DAGs、TAGs。Hu 等［29］樟樹籽油進行GC和反相HPLC檢測，確定了酯類組成［28］。天然油脂中DAG質量分數(shù)低于10%(m/m)［29］。對比樟樹籽油及樟樹籽油水解產(chǎn)物的HPLC圖，依據(jù)圖譜的變化可確定各類甘油酯，圖1中顯示峰1、峰2為脂肪酸和單甘脂，峰3、峰4為DAG，峰5為TAG。

圖1 樟樹籽油水解產(chǎn)物的HPLC圖

2.2 脂肪酶的選擇

Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozym 435為3種常用固定化脂肪酶，Babicz等［30］催化水解生產(chǎn)DAG時發(fā)現(xiàn)Lipozyme IM優(yōu)于Novozym 435。脂肪酶選擇的試驗結果表明，Lipozyme RM IM催化產(chǎn)物中DAG和TAG質量分數(shù)分別為51.34%和37.94%，而Lipozyme TL IM催化產(chǎn)物中DAG和TAG質量分數(shù)分別為35.37%和57.85%。以 CSO為底物，經(jīng)Lipozyme RM IM催化反應后，目標產(chǎn)物DAG的轉化率明顯高于Lipozyme TL IM，故以Lipozyme RM IM為催化劑，繼續(xù)進行其水解反應工藝優(yōu)化的研究。

2.3 預處理對Lipozyme RM IM使用次數(shù)的影響

對Lipozyme RM IM進行預處理發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)溶劑預處理的Lipozyme RM IM使用次數(shù)為9次，而經(jīng)丙酮或叔丁醇預處理之后，使用次數(shù)增加為10和11次。通過預處理不但可以提高酶的反應次數(shù)，而且酶的使用壽命也能夠有效延長［31］，不同的有機溶劑對酶活性的提高影響很大。在適宜條件下，有機溶劑浸泡后的脂肪酶的活性和反應次數(shù)都得以增加，其可能的原因是有機溶劑使固定化酶的疏水基由原來的閉合狀態(tài)轉為張開狀態(tài)，從而使活性部位暴露，構象的改變導致疏水底物趨向與脂肪酶鍵合，使其活性和使用壽命得以提高［32］。

2.4 模型評價

以DAG和TAG質量分數(shù)作為響應值(表1)，模型中R2為0.979 1 和0.985 4，校正R2為0.952 2 和0.966 6，方差分析(表2)也顯示 P 值均小于0.001，表明該模型極顯著，其中兩者的失擬項分別為0.068 9 和0.311 9，影響不顯著，說明該模型不失擬，表明該模型成功有效。因此，該模型適合CSO制備DAG工藝的優(yōu)化。

表1 Lipozyme RM IM催化樟樹籽油水解生成DAG的Behnken－box設計及產(chǎn)物中DAG和TAG的質量分數(shù)

2.5 對DAG質量分數(shù)及TAG質量分數(shù)影響的主要因素及相互作用

影響脂肪酶催化水解生成DAG的主要因素有:加酶量、含水量、反應溫度。通過DAG和TAG質量分數(shù)的后項消去回歸的系數(shù)及P值分析表明(表3)，在3個因素中，含水量對DAG的生成影響最大，其次為溫度，加酶量影響最小。本試驗中，加酶量對DAG質量分數(shù)的影響呈曲線，表明在反應過程中加酶量的最優(yōu)值為10%(圖2a)。酶的持續(xù)增加可以增加反應速度，但DAG總量不變，過量甚至可能會導致形成顆粒而減少接觸面積，從而減緩反應速度。DAG含有一個羥基，在自然環(huán)境中親水，導致DAG在水解反應過程中比 TAG更敏感［30］，故含水量對DAG質量分數(shù)的影響最為顯著。水作為反應介質，在水解過程中，DAG質量分數(shù)增加和TAG質量分數(shù)減少，最終形成動態(tài)平衡。起始反應過程中，TAG水解率大于DAG水解率，但隨著反應進行而逐漸相反(圖2b)。

溫度影響脂肪酶反應的活性，較低溫度使酶活性降低，進而降低反應速度;較高溫度能夠使反應速度加快，但超過最適宜溫度時，溫度升高則抑制酶活性，甚至會使酶失活。雖然升溫能夠增加水解作用，但由于升溫使酶鈍化而敏感，65℃為最適合反應溫度(圖2c)。

圖2 影響DAG質量分數(shù)的主要因素

表2 方差分析表

由表3可知，以DAG質量分數(shù)為響應值時，含水量和溫度的交互作用顯著。評估含水量和溫度之間的相互作用，酶作為中介對DAG影響顯著(P＜0.05)，基于響應面圖(圖3)可以觀察到含水量和溫度可以增加到較高值。在一定的范圍內(nèi)，增加含水量和溫度可以增加DAG質量分數(shù)，反之含水量超過40%，則DAG質量分數(shù)相應減少。以TAG質量分數(shù)作為響應值時，加酶量、含水量和溫度兩兩之間的交互作用均顯著(P＜0.05)，其中溫度和含水量的交互作用對TAG質量分數(shù)的影響最大，其次為加酶量和含水量。通過響應面圖(圖4)可以觀察到，加酶量和含水量保持在較低水平。通過以上分析及模型預測可知，脂肪酶催化CSO生成DAG的最優(yōu)化條件:加酶量為10%，含水量為40%，溫度為65℃，在此條件下得到的DAG質量分數(shù)為50.38%，TAG質量分數(shù)為40.68%。

在優(yōu)化條件下進行驗證試驗，得到的DAG質量分數(shù)和TAG質量分數(shù)分別為51.22%和35.61%，優(yōu)于理論預測值，故此模型得到的水解條件準確可靠。

表3 DAG和TAG質量分數(shù)的后項消去回歸的系數(shù)及P值

3 結論

本試驗中，催化樟樹籽油水解制備DAG的最佳固定化脂肪酶為Lipozyme RM IM，在對Lipozyme RM IM進行預處理試驗中，以叔丁醇預處理效果較好，能夠使其重復使用的次數(shù)達到11次。在Lipozyme RM IM催化水解生成CSO－DAG的反應過程中，采用響應面分析優(yōu)化水解反應，得到的最佳反應條件是:加酶量為10%，含水量為40%，溫度為65℃。反應產(chǎn)物中DAG質量分數(shù)可達50.38%。

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