祖亭月 何美瑩 張連富

(江南大學(xué)食品學(xué)院1，無錫 214122)

(云南省熱帶作物科學(xué)研究所2，景洪 666100)

橡膠籽(Rubber seed)是橡膠種植業(yè)的副產(chǎn)品，種仁含油率高達(dá)50%，且橡膠籽油中不飽和脂肪酸含量很高，因此橡膠籽是一種優(yōu)質(zhì)的油料資源。我國現(xiàn)有橡膠種植面積約49.3萬 hm2，主要分布在海南和云南兩省。據(jù)估計(jì)，我國橡膠籽年產(chǎn)量可達(dá)80萬噸，預(yù)計(jì)可生產(chǎn)橡膠籽油35萬噸［1］。橡膠籽油有著悠久的食用歷史，我國對(duì)橡膠籽油的利用始于20世紀(jì)50年代后期，當(dāng)時(shí)國內(nèi)生活資料十分匱乏，食用油更是短缺。植膠農(nóng)場就開始了用橡膠子油作為食用油的利用實(shí)踐。與此同時(shí)，華南熱帶作物研究院、云南省熱帶作物科學(xué)研究所、昆明醫(yī)學(xué)院、海南醫(yī)學(xué)院等科研院所也加快了對(duì)橡膠種子油的成分、安全性、功能性等方面的研究，取得了60余項(xiàng)成果(含論文成果)。研究結(jié)果表明，精煉的橡膠籽油不但可以食用，還可以降低血脂膽固醇，對(duì)治療和預(yù)防動(dòng)脈硬化及心血管系統(tǒng)疾病有明顯的療效［2－3］。

水酶法提油工藝是一種新興的提油方法，它通過機(jī)械和酶解來降解植物的細(xì)胞壁，使細(xì)胞中的油脂釋放出來［4］。水酶法提油與傳統(tǒng)工藝相比，有如下優(yōu)點(diǎn):能夠保證較高的游離油得率，得到無有機(jī)溶劑殘留的可以直接食用的油;處理?xiàng)l件溫和，所提取的油純度高，色澤淺，酸值及過氧化值低;蛋白質(zhì)變性程度小，有利于殘?jiān)械鞍踪|(zhì)的綜合利用;與溶劑浸提法相比，水酶法提油所產(chǎn)生的廢水BOD和COD下降30% ～40%，有利于環(huán)境保護(hù)和油脂工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［5］。目前，水酶法已廣泛應(yīng)用于芝麻油、大豆油、玉米胚芽油、花生油等的提?。?－9］，但是未見在橡膠籽油提取方面的利用。鑒于橡膠籽油的高產(chǎn)量，研究水酶法在橡膠籽油提取方面的應(yīng)用是很有價(jià)值的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橡膠種子:云南熱帶作物研究所提供;檸檬酸、磷酸氫二鈉(分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;果膠酶、水解蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、中性蛋白酶、復(fù)合植物水解酶、β－葡聚糖酶:諾維信公司;山梨醇單月桂酸酯(司盤－20)、聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯(吐溫－60)(分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SXJQ－1型數(shù)顯直流無極調(diào)速攪拌器:鄭州長城科工貿(mào)有限公司;控溫水浴鍋:江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;DELTA 320 pH計(jì):梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;EBA20離心機(jī):德國Hettich公司;600克搖擺式高速中藥粉碎機(jī):溫嶺市林大機(jī)械有限公司;GC－2010氣象色譜儀:日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 橡膠籽基本成分的測(cè)定

水分測(cè)定:GB/T 5009.3—2003直接干燥法;粗蛋白測(cè)定:GB/T 5009.5—2003凱式定氮法;粗脂肪測(cè)定:GB/T 5512—2008索氏提取法;粗纖維含量的測(cè)定:GB/T 5009.10—2003酸性洗滌法;灰分含量的測(cè)定:GB/T 2009.4—2003重量法;氰化物測(cè)定:GB/T 5009.36—2003糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。

1.3.2 橡膠籽油提取工藝流程和提取率計(jì)算公式

式中:A為游離油Ⅰ的質(zhì)量/g;B為橡膠籽的質(zhì)量/g;ω為橡膠籽中油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%;C為游離油Ⅱ的質(zhì)量/g。

1.3.3 橡膠籽的破碎

采用中藥粉碎機(jī)在25 000 r/min的轉(zhuǎn)速下對(duì)橡膠籽進(jìn)行破碎，每次破碎時(shí)間為4 s，分別破碎1～5次，得到不同粒徑分布的橡膠籽粉末。根據(jù)游離油Ⅰ得率和總游離油得率考察不同粒徑對(duì)游離油得率的影響。

1.3.4 酶制劑與酶解工藝參數(shù)的研究

取50 g破碎后的橡膠籽，依照1.3.2工藝，加入原料4倍的緩沖液，調(diào)節(jié)適宜的pH和溫度，加入料液總質(zhì)量0.5%的酶，酶解反應(yīng)4 h，80℃滅酶10 min，5 000 r/min離心30 min，分別計(jì)算游離油Ⅰ得率和總游離油得率，根據(jù)提取率篩選出最佳酶制劑。由于使用單一酶的酶解效果往往較差，因此考慮將兩種酶復(fù)配使用，以提高清油的得率，方法同上，篩選出最佳組合。

在確定復(fù)合酶的種類后，研究固液比、酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶的添加量對(duì)清油提取率和總油提取率的影響，分析不同條件對(duì)橡膠籽油水酶法提油的影響，試驗(yàn)重復(fù)1次。最后做4因素3水平正交試驗(yàn)，確定最佳的酶解工藝參數(shù)。

1.3.5 破乳方法

將乳狀液在沸水浴中加熱10 min，用離心機(jī)在6 000 r/min下離心15 min，得到破乳油，即游離油Ⅱ。

1.3.6 橡膠籽油的質(zhì)量評(píng)定

1.3.6.1 油脂脂肪酸組成的分析

將壓榨法和水酶法提取出的橡膠籽油經(jīng)甲酯化后用島津GC－2010色譜儀分析。

檢測(cè)器:氫火焰離子化檢測(cè)器;分析柱:PEG－20M交聯(lián)石英毛細(xì)管柱20 m×0.25 mm;柱溫:200℃;載氣:N2。

1.3.6.2 油脂常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定

透明度、氣味、滋味檢驗(yàn):GB/T 5525—2008;色澤檢驗(yàn):GB/T 22460—2008;水分及揮發(fā)物檢驗(yàn):GB/T 5528—1995;不溶性雜質(zhì)檢驗(yàn):GB/T 15688—2008;酸值檢驗(yàn):GB/T 5530—1998;過氧化值檢驗(yàn):GB/T 5538—2005;氰化物檢驗(yàn):GB/T 5009.36—2003糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠種子成分分析

測(cè)得的脫殼橡膠籽主要成分及組成見表1。

表1 橡膠籽主要成分及組成

由表1可知，橡膠籽的粗脂肪和粗蛋白含量都很高，具有很高的利用價(jià)值。水分含量各文獻(xiàn)報(bào)道不一［10］，與貯藏時(shí)間和干燥程度有關(guān)。

2.2 破碎次數(shù)對(duì)得率的影響

將原料進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠扑?，有助于?xì)胞中油滴的釋放［11］，增加游離油得率。從圖1可以較直觀的看出，破碎程度較高的細(xì)胞，油脂釋放較容易。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［12］，破碎有干法破碎和濕法破碎，但是由于濕法破碎容易產(chǎn)生乳狀液，降低提取率，故本試驗(yàn)只采用干法破碎。不同破碎次數(shù)下游離油Ⅰ和總游離油得率的結(jié)果見圖2。

圖1 不同破碎程度對(duì)油脂釋放的影響

圖2 不同破碎次數(shù)對(duì)游離油得率的影響

從圖2可以看出，隨著粒徑的減小，游離油得率增大。但是在粒徑較大時(shí)，形成的乳狀液較少，隨著粒徑的減小，形成的乳狀液增多，這是因?yàn)槿艹隽烁嗟牡鞍踪|(zhì)，與油發(fā)生了乳化。因此選擇破碎3次得到的橡膠籽粉末進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 酶制劑對(duì)得率的影響

2.3.1 單一酶制劑對(duì)得率的影響

水酶法是用酶水解油料細(xì)胞的細(xì)胞壁、脂蛋白或脂多糖，使其中包裹的油釋放出來，以提高得油率。橡膠籽仁細(xì)胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)，故選取可以水解這些物質(zhì)的酶進(jìn)行試驗(yàn)。本試驗(yàn)主要選取了果膠酶、水解蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、中性蛋白酶、復(fù)合植物水解酶、β－葡聚糖酶，用以上酶分別處理后，以游離油Ⅰ提取率為指標(biāo)對(duì)不同酶制劑的作用效果進(jìn)行比較，結(jié)果見圖3。

圖3 單一酶制劑對(duì)游離油得率的影響

由圖3可以看出，在無酶的條件下，游離油Ⅰ得率僅為22.6%，總游離油得率也僅為25.8%。單獨(dú)使用其他酶，得率有所提高，但是總體水平不高。這是因?yàn)槊恳环N酶有其酶解的專一性，單獨(dú)使用效果有限，故考慮將酶復(fù)配使用，以提高提油率。

2.3.2 復(fù)配酶制劑對(duì)得率的影響

將兩種不同的酶復(fù)配后進(jìn)行酶解，以得率為指標(biāo)，對(duì)酶解效果進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4。

圖4 復(fù)配酶制劑對(duì)游離油得率的影響

由圖4可以看出，將酶制劑復(fù)配可以顯著提高得率。這是因?yàn)榧?xì)胞壁的組成成分主要是纖維素和多糖類物質(zhì)，若只用單一酶處理很難將其分解完全。其中，酶組合5得油率最高，且乳狀液形成量較少，故選取這一組合為復(fù)配酶制劑組合。

試驗(yàn)還嘗試了將3種酶復(fù)配進(jìn)行比較，但是得油率未有明顯提高，考慮到生產(chǎn)成本，故選用纖維素酶與β－葡聚糖酶作為復(fù)合酶制劑。

2.4 酶解條件對(duì)得率的影響

2.4.1 固液比對(duì)游離油得率的影響

固定反應(yīng)條件為pH 4.5，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間4 h，加酶量為0.5%(每種酶單獨(dú)的添加量)，研究不同固液比對(duì)游離油得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 固液比對(duì)游離油得率的影響

由圖5可以看出，開始時(shí)隨液體比例的增加，游離油的得率也隨之增加，至1∶4時(shí)達(dá)到最大值，隨后液體再增加，油得率逐漸降低。固液比較低時(shí)，乳狀液形成量較少，隨著固液比增大，由于蛋白質(zhì)溶出量增多，乳狀液的量也增大。故選取固液比為1∶4，此時(shí)游離油得率較高，且乳狀液生成量適中。

2.4.2 pH對(duì)游離油得率的影響

pH影響著酶的活性，也影響著蛋白質(zhì)的溶解度。為得到較多的澄清油，盡量防止乳化的發(fā)生，有必要對(duì)不同pH的作用效果進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4。其他酶解條件為溫度50℃，固液比1∶4，酶解時(shí)間4 h，酶添加量為 0.5%。

圖6 不同pH對(duì)游離油得率的影響

由圖6可以看出，pH較低時(shí)游離油得率較低，隨著pH的升高，游離油得率隨之升高，至pH 5.0時(shí)達(dá)到最大，游離油得率為72.3%。還可以看出，在較低pH時(shí)，乳狀液生成量較低，隨pH升高，乳狀液的生成量也升高，從而導(dǎo)致游離油得率降低。因?yàn)閜H影響著蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，在pH較高時(shí)，有較多的蛋白質(zhì)溶解在油中，起到了表面活性劑的作用，導(dǎo)致較多的乳狀液形成。從圖6可以看出，在pH 5.0時(shí)，游離油得率最高，且乳狀液生成量較低，故選取pH 5.0為最佳反應(yīng)pH。

2.4.3 酶解溫度對(duì)游離油得率的影響

酶解溫度對(duì)于酶的活性影響很大，通常溫度高時(shí)酶活性較大。纖維素酶與β－葡聚糖酶的最適溫度為40～60℃。不同溫度下酶解效果見圖5。其他條件為:固液比1∶4，pH 5.0，酶解時(shí)間4 h，酶添加量為0.5%。

圖7 溫度對(duì)游離油得率的影響

由圖7可以看出，游離油得率隨溫度升高而增大，50℃時(shí)達(dá)最大，得率為73.5%。之后溫度繼續(xù)升高，游離油得率下降加速，原因是溫度過高，加速了酶的失活，從而減弱了酶解作用，導(dǎo)致游離油得率下降。乳狀液的生成隨溫度升高而降低，這是因?yàn)楦邷亟档土巳闋钜旱姆€(wěn)定性，有助于破乳。但為了得到較高的游離油得率，選取最適酶解溫度為50℃。

2.4.4 酶解時(shí)間對(duì)游離油得率的影響

酶與底物接觸的時(shí)間越長，酶解得越徹底，故研究酶解時(shí)間對(duì)游離油得率的影響。其他反應(yīng)條件為:固液比 1∶4，pH 5.0，溫度 50 ℃，酶添加量為0.5%。結(jié)果見圖 8。

圖8 酶解時(shí)間對(duì)游離油得率的影響

由圖8可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長，提油率緩慢增長，但是超過12 h后，游離油得率都開始下降，原因可能是油與蛋白質(zhì)接觸時(shí)間過長，產(chǎn)生了穩(wěn)定的乳狀液，破乳也比較困難。還可以看出，在酶解時(shí)間為8、10、12 h時(shí)，游離油得率幾乎沒有變化，考慮到生產(chǎn)成本，選擇酶解時(shí)間為8 h較適合。

2.4.5 酶添加量對(duì)游離油得率的影響

選取不同的酶添加量，考察其對(duì)游離油得率的影響。其他反應(yīng)條件為:固液比1∶4，反應(yīng)時(shí)間4 h，反應(yīng)溫度50℃，pH 5.0。結(jié)果見圖9。

圖9 不同酶添加量對(duì)游離油得率的影響

由圖9可以看出，游離油得率隨酶添加量的增加而略有增加，當(dāng)酶添加量增加到0.7%時(shí)，游離油得率反而降低。這可能是由于隨著酶添加量的增加，油釋放的速度加快，乳狀液形成速度隨之增加，導(dǎo)致游離油得率降低。同時(shí)，酶添加量增加，容易形成穩(wěn)定的乳狀液，導(dǎo)致破乳困難，使總游離油得率也略有下降。

2.4.6 酶解工藝的優(yōu)化

選取固液比，酶解時(shí)間，酶添加量，酶解溫度進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，按L9(34)設(shè)計(jì)正交表，以總游離油得率為指標(biāo)，正交試驗(yàn)的因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

按照L9(34)設(shè)計(jì)，以總游離油得率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 方差分析表

極差分析和方差分析結(jié)果表明，影響總游離油得率因素的順序?yàn)槊附鈺r(shí)間＞酶解溫度＞酶添加量＞固液比，其中，酶解時(shí)間對(duì)結(jié)果影響顯著，最佳反應(yīng)組合為A1B2C3D2。但是組合A1B2C2D2與最佳組合相比，相差不大，但是反應(yīng)條件比最佳組合低，考慮到生產(chǎn)成本，故選取組合A1B2C2D2代替最佳組合。即酶解工藝確定為固液比1∶4，酶解時(shí)間8 h，酶添加量0.5%，酶解溫度50℃。

3 橡膠籽油質(zhì)量評(píng)定

3.1 橡膠籽油的脂肪酸組成

將水酶法提取的橡膠籽油處理后，測(cè)定其脂肪酸組成，結(jié)果見圖10a。同樣方法分析壓榨橡膠籽油的脂肪酸組成，結(jié)果見圖10b。

圖10 不同方法提取的橡膠籽油的脂肪酸氣相色譜圖

將圖10的峰經(jīng)歸一化處理后得到的橡膠籽油主要脂肪酸組成見表5?？梢钥闯?，橡膠籽油不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)很高，達(dá)到了84.5%，因此橡膠籽油是一種具有很好的保健作用的新的食用油。水酶法提取油與壓榨法提取油的脂肪酸組成無明顯差別，說明水酶法工藝對(duì)于油的品質(zhì)沒有破壞，進(jìn)一步說明了水酶法提取橡膠籽油工藝是可行的。

表5 橡膠籽油的主要脂肪酸組成

3.2 橡膠籽油的理化指標(biāo)

由于橡膠籽油是一種新型食用油，目前還沒有國標(biāo)來評(píng)定其等級(jí)。將橡膠籽與幾種常見的油料原料進(jìn)行比較，橡膠籽與葵花籽組成最為接近，故選用葵花籽油的國家標(biāo)準(zhǔn)作為橡膠籽油質(zhì)量評(píng)定的依據(jù)，結(jié)果見表6。

表6 橡膠籽油質(zhì)量評(píng)定

將水酶法和壓榨法得到的橡膠籽油分別進(jìn)行了氰化物的定性檢測(cè)，水酶法提取的橡膠籽油未檢出氰化物，但是壓榨法提取的橡膠籽油檢出了氰化物。因此，采用水酶法提取的橡膠籽油無需進(jìn)一步進(jìn)行氰化物的脫除，從而簡化了制取工藝。

由表6可以看出，用水酶法得到的橡膠籽油除酸值偏高外，其余均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。酸值偏高的原因一方面是因?yàn)樵腺A存較久，另一方面是因?yàn)樗阜ㄌ崛」に囀窃谳^低的pH下進(jìn)行的，pH約為5.0，導(dǎo)致游離油的酸值偏高。而且，H+可以作為油脂水解的催化劑，促使油脂發(fā)生水解反應(yīng)，游離脂肪酸增加，酸值也會(huì)隨之增高。

水酶法提取的橡膠籽油，只需進(jìn)行脫酸得到符合標(biāo)準(zhǔn)的成品油，比起壓榨法提取工藝需要脫膠、脫酸、脫臘、脫水、脫臭、脫色等精煉步驟而簡化了許多，從而使生產(chǎn)效率得到了提高，并且減少了污染。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了工藝參數(shù)，確定了水酶法的最佳提取工藝為固液比1∶4，酶解時(shí)間8 h，酶添加量0.5%，酶解溫度50℃，pH 5.0。在5 000 r/min下離心 30 min，然后對(duì)乳狀液進(jìn)行加熱破乳，破乳條件為沸水浴10 min，6 000 r/min下離心10 min。最后總游離油得率可達(dá)到89.3%。

采用水酶法提取的橡膠籽油，品質(zhì)較好，后續(xù)所需精煉步驟簡單，節(jié)約了精煉步驟所需的成本。提取率高于壓榨法的提取率(約66%)，并且，水酶法的反應(yīng)條件溫和，蛋白質(zhì)變性小，可對(duì)殘?jiān)械牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行回收，有利于原料的綜合利用。

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