王章存 李樂靜 趙學(xué)偉 崔勝文 胡金強 王吉中

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002)

豆粕是大豆低溫浸出制油后的副產(chǎn)品，含蛋白質(zhì)達45%以上，在食品工業(yè)和動物飼料生產(chǎn)中具有重要作用。但大豆也是公認(rèn)的八大食物過敏源之一，豆粕中主要蛋白質(zhì)成分——7S和11S球蛋白也是主要的抗原蛋白，它們對熱穩(wěn)定，一般加熱方法不能消除其抗原性［1］。若過度加熱將導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)變性，影響其消化利用率。研究表明，大豆蛋白的抗原性源于它們的亞基組成，7S中的β－伴大豆球蛋白是分子質(zhì)量為140～180 ku的糖蛋白，它是由α、α'和β三種亞基按一定方式組合而成的三聚體［2－3］，其中α和α'亞基的抗原性最強［4］。11S球蛋白是分子質(zhì)量為300～380 ku的六聚體復(fù)合物，由6個酸性(A)亞基和6個堿性(B)亞基組成，其中酸性亞基可以引起人體和動物的過敏反應(yīng)［5］。這些蛋白質(zhì)的大分子結(jié)構(gòu)及其形成的抗原決定族是它們表現(xiàn)抗原性的重要基礎(chǔ)［6］。酶解方法則可降解大豆蛋白分子，破壞大豆抗原蛋白的結(jié)構(gòu)和抗原決定族。據(jù)報道，大豆11S球蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解為20 ku小分子后即可失去抗原活性［7］，用大豆分離蛋白的酶解結(jié)果也支持這一結(jié)論［8］。然而，盡管目前關(guān)于大豆蛋白酶解的報道很多，但有關(guān)酶解過程中大豆蛋白分子組成變化的研究較少，以豆粕為原料的研究更少。本研究選用Alcalase蛋白酶對此進行研究，為探討有效消除豆粕中抗原蛋白的酶解方法提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

低溫脫脂豆粕:山東嘉華油脂有限公司;堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 AU/g):諾維信公司;巰基乙醇(ME)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris):Sigma公司;N，N，N'，N'－四甲基乙二胺(TEMED):FLUKA 公司;丙烯酰胺(Acr)、N，N'－亞甲基雙丙烯酰胺(Bis):Amresco公司;考馬斯亮蘭R250(FLUKA公司);低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Mr.14 400～97 400，上海生物化學(xué)研究所;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

DYY－7C型電泳儀、DYCZ－24DN型電泳槽:北京六一儀器廠;UV－8100 B紫外可見分光光度計:北京LabTech萊伯泰科儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫脫脂豆粕的酶解

取粉碎過60目的豆粕樣品加水配制成8%的溶液，加熱至55℃后用1 mol/L NaOH調(diào)至pH 8.0，然后按酶/蛋白質(zhì)比例為1∶100加入堿性蛋白酶。反應(yīng)開始后，滴加 NaOH溶液維持pH恒定，并記錄消耗NaOH體積。反應(yīng)到預(yù)定時間后，將反應(yīng)液在沸水浴中加熱10 min滅酶，1 500 r/min離心10 min，沉淀部分用2倍體積水洗滌2次，合并上清液并冷凍干燥。

1.3.2 蛋白質(zhì)的溶解性測定

雙縮脲法測定可溶性蛋白質(zhì)含量，與酶解液中總蛋白質(zhì)含量的百分比值，即為蛋白質(zhì)的溶解性。

1.3.3 水解度(DH)的測定

采用pH－stat法。

1.3.4 酶解物在三氯乙酸中的溶解性測定

取凍干的可溶性酶解樣品0.5 g，加入35℃預(yù)熱的10%三氯乙酸(TCA)溶液20 mL，振搖10 min后，1 500 r/min離心10 min。雙縮脲法測定上清液中蛋白質(zhì)含量，計算其與樣品中蛋白含量比值。

1.3.5 SDS－PAGE 分析

采用 Laemmli系統(tǒng)［9－10］。電泳條件:濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12%，初始電壓為80 V，分離時改用110 V。采用低分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，考馬斯亮藍R－250染色。水不溶性樣品和TCA不溶性樣品先用pH 10.0 NaOH溶液溶解，TCA可溶性蛋白溶液先調(diào)至pH 8.0后再進行SDS－PAGE分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Gel－Pro Analyzer軟件定量分析了SDSPAGE圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時間對大豆蛋白溶解性和水解度的影響

不同酶解時間條件下大豆蛋白質(zhì)溶解性和水解度(DH)測定結(jié)果如圖1所示。酶解10 min時蛋白質(zhì)的溶解性由未酶解時的62.3%快速增加到87.19%，但其后隨著酶解時間的延長，其溶解性的增加并不顯著，說明豆粕中的蛋白質(zhì)易被Alzalase酶解而溶解。

水解度也隨酶解時間的延長而增加。但大豆蛋白水解度與其溶解性的變化幅度并不同步，如酶解10 min時，溶解性已達到較高水平(87.19%)，而水解度僅為 4.8%;酶解 60 min時，溶解性增加到95.1%。而水解度則增加到6.9%(提高約 50%)。這說明，那些因酶解而呈溶解狀態(tài)的大豆蛋白或肽分子在溶液中繼續(xù)被酶水解。

圖1 酶解時間對豆粕蛋白溶解率和水解度的影響

2.2 酶解時間對TCA可溶性酶解物含量的影響

三氯乙酸(TCA)可以使蛋白質(zhì)大分子變性沉淀，而小分子蛋白質(zhì)或肽則不易沉淀。在營養(yǎng)學(xué)上，蛋白質(zhì)酶解物在TCA中的溶解性往往是評價該產(chǎn)物是否符合小分子活性肽的重要指標(biāo)之一。本試驗分析了不同時間酶解物在TCA中溶解性的變化(圖2)，可以看出，隨著酶解時間的延長，可溶于TCA的蛋白質(zhì)/肽分子的比例越來越高，意味著大豆蛋白質(zhì)分子的降解較多。

圖2 不同時間酶解物在TCA中的溶解性

2.3 酶解過程中大豆蛋白分子亞基的變化

2.3.1 酶解后水可溶性蛋白質(zhì)成分的變化

用SDS－PAGE方法分析了不同酶解時間條件下豆粕中蛋白組分及其含量變化(圖3)，可以看出，在未酶解的豆粕中，可溶性的酶解物有多種蛋白質(zhì)組分。酶解10 min時，7S中的α'、α和β三個亞基已完全消失，11S中的38 ku酸性亞基和21 ku堿性亞基含量也明顯減少，與此同時，新產(chǎn)生了23 ku(箭頭a)和大量的分子質(zhì)量小于14 ku組分。60 min時，38 ku亞基完全消失，90 min時，21 ku亞基幾乎完全消失，且23 ku組分含量也開始減少，同時，分子質(zhì)量小于14 ku組分的含量明顯增加。而整個酶解過程中，15 ku堿性組分始終沒有被酶解的跡象。這些結(jié)果表明，豆粕中的7S抗原蛋白很容易被Alcalase酶水解，而11S球蛋白的堿性亞基對該酶的敏感程度較弱。對于11S球蛋白酸性亞基先于堿性亞基被酶水解的解釋是，堿性亞基含有相對較多的疏水性氨基酸，在形成高級結(jié)構(gòu)時它們位于11S球蛋白分子的內(nèi)部，而酸性亞基則位于球形的外部［6，11］。

圖3 酶解豆粕可溶性成分的SDS－PAGE

2.3.2 酶解后豆粕殘余物中蛋白質(zhì)成分的變化

為了較全面了解酶解豆粕中蛋白質(zhì)分子變化情況，按照司曉霞等［10］的方法對酶解離心后不溶于水的豆粕殘余物的蛋白進行提取并做SDS－PAGE分析(圖4)，這也是目前研究中常被回避的重要問題?？梢钥闯?，酶解10 min時，豆粕中已經(jīng)不存在α'、α亞基，11S中的酸性組分含量也大大減少，酶解60 min時已全部消失。但屬于7S伴球蛋白的β亞基、11S的B3堿性亞基的含量反而有增加的趨勢，可能是酶解7S和11S蛋白質(zhì)分子中的α＇、α亞基和A3酸性亞基后，導(dǎo)致不太易水解的β亞基和B3堿性亞基含量相對增加。也可能是酶解后豆粕中這些亞基是以某種聚集體形式存在但不溶于水，當(dāng)電泳分析時由于巰基乙醇處理后溶解，從而在電泳譜帶中顯示含量增加。

文獻中對高純度大豆分離蛋白的酶解研究認(rèn)為，當(dāng)大豆蛋白降解為分子質(zhì)量小于20 ku后，其抗原性消失［7－8］，國外大豆水解蛋白嬰兒奶粉中的分子質(zhì)量一般小于28 ku且被認(rèn)為是安全的［12］。本試驗研究顯示，雖然在水不溶性酶解豆粕中仍有分子質(zhì)量為20～52 ku的組分，但由于這部分酶解豆粕所占比例只有約5%(圖1)，因此整個酶解豆粕的飼用安全性得到明顯改善。

圖4 酶解豆粕殘余物中蛋白質(zhì)SDS－PAGE

2.4 TCA溶解性蛋白質(zhì)的分子特征

為進一步了解酶解豆粕在TCA中溶解與蛋白質(zhì)分子特征之間的關(guān)系，用SDS－PAGE分析了TCA可溶性組分及不溶性組分(圖5)?？梢钥闯觯疵附舛蛊芍斜M管有60%以上(圖1)蛋白質(zhì)可溶于水，但可溶于TCA中的成分極少(14.4 ku和8 ku，圖5a)，絕大多數(shù)成分不能溶于TCA(圖5b)。而酶解后溶于TCA中的成分很多(幾乎全部是20 ku以下的小分子)，由于這些組分是酶解后生成的小肽分子，它們分子質(zhì)量的差別不足以在電泳中拉開距離，因而譜帶不清晰(利用tricine－SDS－PAGE也無法將其分離清晰)。值得注意的是，仍有一些小分子(如17 u、10 ku)組分也不能溶于TCA。這些結(jié)果也表明，文獻中以是否在TCA中溶解來直接判斷分子大小的做法并不適合于大豆蛋白酶解物的評價。

圖5 TCA可溶蛋白和不溶蛋白的SDS－PAGE圖譜

3 結(jié)論

豆粕因其抗原蛋白的存在大大限制了其在幼小動物飼料中的使用量。本研究表明，堿性蛋白酶不僅有效改善豆粕中大豆蛋白的溶解性能，也快速將絕大部分大豆抗原蛋白降解為21 ku以下的肽，大大改善豆粕的飼用安全性。

［1］秦貴信，孫澤威，趙元，等.大豆中主要抗原蛋白的研究進展［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，30(4):553－558

［2］Amigo － Benavent M，Clemente A，F(xiàn)erranti P，et al.Digestibility and immunoreactivity of soybean β－conglycinin and its deglycosylated form［J］.Food Chemistry，2011，129:1598 －1605

［3］Maruyama N，Katsube Tomoyuki，Wada Y，et al.The roles of the N －linked glycans and extension regions of soybean β －conglycinin in folding，assembly and structural features［J］.Eur.J.Biochem，1998，258(2):854 －862

［4］Krishnan HB，Kim WS，Jang S，et al.All three subunits of soybean β － conglycinin are potential food allergens［J］.J.Agricul.Food Chem.，2009，57(3):938 －943

［5］Adachi M，Kanamori J，Masuda T，et al.Crystal structure of soybean 11S globulin:glycinin A3B4 homohexamer［J］.The Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，100(12):7395－7400

［6］Shreffler WG，Beyer K，Chu TT，et al.Microarray immunoassay:association of clinical history，in vitro IgE function，and heterogeneity of allergenic peanut epitopes［J］.J Allergy Clin Immunol，2004，113(4):776 －782

［7］Lee HW，Keum EH，Lee SJ，et al.Allergenicity of proteolytic hydrolysates of the soybean 11S globulin［J］.J.Food Sciences，2007，72(3):168 －172

［8］Song YS，Martinez－ Villaluenga C，De Mejia EG.Quantification of Human IgE Immunoreactive Soybean Proteins in Commercial Soy Ingredients and Products［J］.J.Food Science，2008，73(6):T90 － T99.

［9］夏其昌等編.蛋白質(zhì)電泳技術(shù)指南［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007

［10］司曉霞，王志，霍斐，等.大豆中β－伴大豆球蛋白提純方法的優(yōu)化［J］.植物學(xué)報，2011，31(4):397－402

［11］Shutov AD，Kakhovskaya IA，Bastrygina AS，et al.Limited proteolysis of β － conglycinin and glycinin，the 7S and 11S storage globulins from soybean:Structural and evolutionary implications［J］.Eur.J.Biochem，1996，241:221 －228

［12］Franck P，Moneret V，Dousset B，et al.The allergenicity of soybean－based products is modified by food technologies［J］.Int Arch Allergy Immunol，2002，128:212 －219.