任慧慧,王玉璇,李雪薇,陳 敏

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

隱藻(cryptophytes)是一類單細(xì)胞、營(yíng)自養(yǎng)生活的真核浮游藻類,是真核紅藻與異養(yǎng)真核宿主經(jīng)過(guò)第二次內(nèi)共生后形成的[1-2]．部分隱藻在進(jìn)化地位和光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)組成上都顯得比較特異,不僅含有葉綠素(chlorophyll,Chl)a、c,還含有隱藻藻膽蛋白．

目前有報(bào)道認(rèn)為,一種隱藻僅留有一種藻膽蛋白[3],或藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)或藻藍(lán)蛋白(phycocyanin,PC)．已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的隱藻藻膽蛋白根據(jù)光譜性質(zhì)的不同共分為8種:分別為藻藍(lán)蛋白PC569(或PC570)、PC577[4]、PC612、PC630、PC645,藻紅蛋白PE545、PE555、PE566[5]．目前的報(bào)道顯示其特點(diǎn)為:(1)都至少含有α1,α2和β 3種發(fā)光亞基,但沒有發(fā)現(xiàn)含有類似紅、藍(lán)藻藻膽蛋白的γ亞基[4];(2)一般以穩(wěn)定的異二聚體(α1β)(α2β)形式存在于類囊體腔中,而非研究較多的紅、藍(lán)藻藻膽蛋白的三聚體或六聚體;(3)隱藻藻膽蛋白含有6種藻膽素色基,其中中膽綠素MBV (mesobiliverdin,最大吸收波長(zhǎng)697 nm)、CB-618色基(最大吸收在618 nm)以及一種CB-584 色基(最大吸收在584 nm)是紅、藍(lán)藻藻膽蛋白所不具備的;(4)隱藻藻膽蛋白的α亞基分子質(zhì)量較小,且只含有一種MBV色基,而β亞基則可能含有2～3種色基[6]．

目前的報(bào)道大多以隱藻藻膽蛋白異二聚體形式為研究對(duì)象[7-10],而對(duì)于拆分、純化后的亞基的特性以及如何保持活性等卻鮮有報(bào)道．實(shí)驗(yàn)室前期工作中發(fā)現(xiàn)[11],藍(lán)隱藻(C.plaoidea)PC645中可能存在新的發(fā)光亞基,作者命其名為β2,但尚未給出氨基酸序列．本文以藍(lán)隱藻純化后的藻藍(lán)蛋白PC645為材料,摸索了大規(guī)模分離和純化活性亞基的方法,并對(duì)所得富含α和β亞基組分的光譜特性、多肽組成、等電點(diǎn)特性和pH耐受性等進(jìn)行了研究,為了解藻藍(lán)蛋白的亞基結(jié)構(gòu)、能量傳遞等提供相應(yīng)理論依據(jù),并為進(jìn)一步的亞基序列分析奠定了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 PC645的分離純化

藍(lán)隱藻(C.plaoidea)的培養(yǎng)、PC645的分離和純化實(shí)驗(yàn)條件參照文獻(xiàn)[12],收集A645/A280大于等于7.0的80%硫酸銨飽和度的PC645樣品,經(jīng)光譜分析和非變性凝膠電泳鑒定純度后,避光保存于4 °C備用．

1.2 光譜分析

藻藍(lán)蛋白樣品用50 mmol/L, pH值為7的PBS緩沖液調(diào)整濃度至A645=15;拆分后的亞基采用含4 mol/L尿素的相同緩沖液調(diào)整濃度至A360=0.5左右,分別使用TU-1900紫外-可見分光光度計(jì)和LS55熒光分光光度計(jì)分別測(cè)定其吸收及熒光光譜．

1.3 非變性凝膠電泳

非變性電泳的實(shí)驗(yàn)方法參見文獻(xiàn)[13],以檢測(cè)PC645純度．

1.4 PC645的尿素變性

用(50 mmol/L, pH值為7的PBS)調(diào)整PC645至A645=10,配成含有4 mol/L和8 mol/L尿素的溶液分別變性48 h后測(cè)定吸收光譜．

1.5 亞基的分離純化

Sephacryl S-100凝膠層析分離藻藍(lán)蛋白PC645亞基的實(shí)驗(yàn)條件參照文獻(xiàn)[14],上樣量調(diào)整為3 mL,以50 mmol/L,pH值為7,含4 mol/L尿素的PBS緩沖液洗脫,流速為12 mL/h,并分別繪制亞基的洗脫曲線．

1.6 SDS-PAGE

將經(jīng)過(guò)Sephacryl S-100凝膠層析分離收集到的亞基樣品按照樣品∶5%SDS溶液=100∶1(V/V)的比例混合處理1 h后進(jìn)行SDS-PAGE,電泳條件參見文獻(xiàn)[7]．

1.7 等電點(diǎn)聚焦(IEF)電泳分析

純化后的PC645以及經(jīng)SephacrylS-100凝膠層析分離后收集到的亞基樣品,參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行IEF電泳分析其等電點(diǎn)特性．

1.8 亞基pH耐受性摸索

將8 mol/L尿素變性后得到的α與β亞基樣品,分別采用66.7 mmol/L(pH值分別為4.92,5.91,6.98,8.04)的PBS緩沖溶液調(diào)整至相應(yīng)pH值,保存于4 °C,分別于7 d、45 d和90 d取樣測(cè)定吸收和熒光光譜,了解拆分后亞基的pH耐受性．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 藻藍(lán)蛋白PC645的分離純化

80%硫酸銨飽和度下的藻藍(lán)蛋白經(jīng)2次分子篩純化后的吸收光譜(圖1(a)實(shí)線)呈現(xiàn)典型的隱藻PC645的特征吸收,其中580、625、645 nm峰分別源于二氫膽綠素DVB(dihydrobiliverdins)、中膽綠素MBV和藻藍(lán)膽素PCB(phycocyanobilins)色基的吸收[15];350～ 400 nm為藻膽蛋白四吡咯色基的吸收區(qū);圖中280 nm吸收峰與脫輔基蛋白的吸收有關(guān),樣品A645/A280的比值可以達(dá)到7或以上．非變性電泳圖譜顯示,PC645樣品在紫外光下(圖2(a))呈現(xiàn)單一熒光條帶;經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色并脫色后,在白光下(圖2(b))也只呈現(xiàn)1條蛋白帶,證明藻藍(lán)蛋白樣品被充分純化,純度可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求．

圖1PC645的吸收光譜和熒光光譜(激發(fā)譜Em=700 nm,發(fā)射譜Ex=580 nm)

Fig.1 Spectral and fluorescence spectra of purified PC645 (Excitation spectra,Em=700 nm. Fluorescence emission,Ex=580 nm)

圖2PC645非變性電泳在紫外燈下和自然光下考染結(jié)果

Fig.2 The native-PAGE profiles of PC645 under UV light or observed by Coomassie brilliant blue staining under natural light

PC645在580 nm激發(fā)光下,只產(chǎn)生一個(gè)660 nm的特征熒光發(fā)射峰(圖1(b)虛線)．在給定發(fā)射波長(zhǎng)700 nm時(shí),只產(chǎn)生屬于藻藍(lán)蛋白PC645的特征熒光激發(fā)峰(圖1(b)實(shí)線),而沒有屬于葉綠素的激發(fā)峰．說(shuō)明純化后的PC645蛋白無(wú)變性,且亞基內(nèi)部色基結(jié)合狀態(tài)完好．

2.2 尿素變性拆分藻藍(lán)蛋白亞基

4 mol/L尿素變性后的PC645樣品在可見光區(qū)的580、625和645 nm特征吸收峰值明顯降低(圖1(a)),但基本形態(tài)未發(fā)生明顯改變,表明仍有一定比例的PC645維持異二聚體狀態(tài);而8 mol/L尿素變性的PC645樣品在此處的特征吸收峰接近完全消失(圖1(a)),呈現(xiàn)一個(gè)620 nm左右的單峰,這是亞基拆分后色基吸收疊加的效果,顯示蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)已完全解體．

此外,2者在350～400 nm左右四吡咯色基的吸收峰均有所變化,但較之未變性狀態(tài)時(shí)增高幅度很小,表明拆分后的亞基中的色基所處的蛋白微環(huán)境沒有明顯變化,三級(jí)結(jié)構(gòu)較完整,色基沒有明顯暴露．因此在本實(shí)驗(yàn)條件下,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)PC645亞基的拆分,并同時(shí)保持拆分后亞基的完整狀態(tài),只是8 mol/L比4 mol/L尿素可使PC645變性更加完全．

2.3 藻藍(lán)蛋白亞基的分離純化

經(jīng)4 mol/L及8 mol/L尿素變性后的PC645的洗脫曲線(圖3)均呈現(xiàn)較為明顯的2個(gè)洗脫峰,先洗脫下來(lái)的為分子質(zhì)量更大一些的藍(lán)色組分,洗脫體積分別為30 mL(blue-1)和40 mL(blue-2);之后洗脫下的為分子質(zhì)量相對(duì)小一些的綠色組分的洗脫體積分別為37 mL(green-1)和45 mL(green-2)．4 mol/L尿素變性的PC645亞基的洗脫體積要明顯小于后者,可能與蛋白變性不完全,因此分子質(zhì)量較大有關(guān)．

Fig.3 The eluting curves of sephacryl S-100 chromatography

2.4 藻藍(lán)蛋白亞基的特性分析

2.4.1 吸收光譜 凝膠層析分離得到的藍(lán)色組分(blue-1和2)和綠色組分(green-1和2)分別呈現(xiàn)相似的吸收特性(圖4)．blue-1和2在600 nm處較寬的吸收峰,應(yīng)該是DBV(最大吸收為590 nm)和PCB(最大吸收峰為620～650 nm)色基吸收疊加造成的,因此藍(lán)色組分應(yīng)為富含β亞基的洗脫組分．其四吡咯色基的吸收主峰在360 nm附近,此外還有一個(gè)420 nm左右肩峰．而green-1和2結(jié)合的四吡咯色基與前者不同,吸收在300～400 nm之間,主峰位于391 nm附近,此外440 nm附近另有一個(gè)較弱的吸收肩峰．在500 nm以上區(qū)域的最大吸收峰值較β亞基吸收波長(zhǎng)更長(zhǎng),主峰分布在600～700 nm,可認(rèn)為是625 nm和694 nm 2個(gè)吸收峰疊加的結(jié)果,前者是結(jié)合在α亞基上的MBV引起的,而后者源于獨(dú)立的MBV色基[16],因而綠色組分應(yīng)是富含α亞基的洗脫成分．

2.4.2 熒光光譜 4種亞基洗脫樣品的熒光光譜特性如圖5所示．在580 nm激發(fā)光下,blue-1和2(富含β亞基)都在660～670 nm附近產(chǎn)生的一個(gè)較寬的熒光發(fā)射峰(圖5(a)和(b)實(shí)線),與PC645的特征熒光發(fā)射相類似,應(yīng)該是在β亞基上共價(jià)結(jié)合的DBV和PCB色基按照能級(jí)順序?qū)⑺鼈兾盏墓饽芤来蝹鬟f,最終到達(dá)末端色基PCB(β82)后產(chǎn)生的末端發(fā)射峰,說(shuō)明拆分后得到的β亞基上各色基依舊保持生物學(xué)活性狀態(tài)且有序排列．green-2組分(圖5(b)虛線)沒有出現(xiàn)屬于PCB色基的660 nm末端熒光發(fā)射;而green-1(圖5(a)虛線)中的660 nm 發(fā)射可能源于少量殘留的β亞基．變性后得到的blue-1和2(β亞基組分)的激發(fā)譜類似(圖5c,d的實(shí)線),在700 nm發(fā)射波長(zhǎng)下,均在605 nm和655 nm有一個(gè)較寬的熒光激發(fā)峰,對(duì)應(yīng)于β亞基上的PCB和DBV色基;green-2(圖5(d)的虛線)在700 nm發(fā)射波長(zhǎng)下無(wú)明顯的熒光激發(fā)峰,而green-1(圖5(c)的虛線)在600～655 nm左右呈現(xiàn)不明顯的起伏,進(jìn)一步說(shuō)明green-2對(duì)700 nm熒光沒有貢獻(xiàn),應(yīng)是不含β亞基的純化的α亞基組分．

2.4.3 SDS-PAGE 在紫外光和考染后白光下blue-1和2的SDS-PAGE圖譜(圖6(a))均顯示2條β亞基條帶,β1分子質(zhì)量為17.8 kU,β2為15.9 kU,但在8～10 kU未見有α亞基組分,顯示亞基基本純化;8 mol/L尿素變性后的green-2只呈現(xiàn)10 kU(α1)和8 kU(α2)2條帶(圖6(b)),但4 mol/L尿素處理的green-1在15～20 kU區(qū)仍然有β亞基成分．顯然8 mol/L尿素濃度可令PC645(A645=10)變性更加徹底,使后續(xù)2種亞基在層析后達(dá)到完全分離的效果．

2.4.4 IEF PC645樣品經(jīng)過(guò)IEF電泳可被拆分成多個(gè)等電點(diǎn)不同的條帶(圖7(a)),其中主要有pI 9.1(α1亞基)、pI 7.1(α2亞基)、pI 6.0(富含β1亞基)及pI 5.7(富含β2亞基)4個(gè)熒光條帶．純化后的β亞基(blue-2)也得到了兩種等電點(diǎn)(pI 6.0/5.7)不同的β亞基(圖7(b)),說(shuō)明PC645的β亞基組成并非單一組分．但沒有等電點(diǎn)高于6的熒光成分,進(jìn)一步證實(shí)層析后所得藍(lán)色β亞基組分已完全排除了α亞基．

2.5 拆分后亞基的pH值耐受性

吸收光譜監(jiān)測(cè)表明,α(green-2)亞基在不同pH條件下,吸收幅度均會(huì)隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而相繼降低(圖8(a),(b),(c),(d)),7 d左右在最大吸收391 nm處吸收值隨pH值升高分別降至α原液的45%、53%、54%、55%左右,但吸收峰仍維持原有的基本形態(tài);貯存45 d后424 nm處的特征吸收肩峰開始消失,光譜形態(tài)出現(xiàn)變化,表明亞基開始變性,三級(jí)結(jié)構(gòu)不再完整．只有pH值為6.98時(shí)儲(chǔ)存90 d的光譜,424 nm肩峰仍可見,說(shuō)明α亞基儲(chǔ)存的pH條件以6.98最佳．

圖8(e),(f),(g),(h)顯示,在pH值為6.98和8.04條件下,β(blue-2)亞基吸收幅度不僅會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低,且在儲(chǔ)存45 d后,吸收峰形態(tài)明顯變化,于360 nm和600 nm處吸收峰均明顯藍(lán)移,說(shuō)明亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)變化,色基周圍蛋白的微環(huán)境遭到破壞;在pH值為4.92和5.91時(shí),7 d內(nèi)吸收幅度在600 nm處吸收值可維持至β原液的89%和84%,但在45 d范圍內(nèi)光譜形態(tài)仍能維持原有的基本形態(tài)．可見,β亞基在pH值為5～6條件下的耐受性較好．

亞基的熒光光譜顯示純化后的α亞基(green-2)在580 nm激發(fā)光下沒有熒光發(fā)射,而β亞基(blue-2)則產(chǎn)生660～666 nm的熒光,類似于PC645的特征熒光峰．相對(duì)于β原液,該熒光強(qiáng)度在pH值為4.92和5.91條件下保存7 d后即相對(duì)降低,但90 d后亞基發(fā)射峰位仍基本維持在相應(yīng)范圍內(nèi)(圖9(a)),特別是pH值為4.92時(shí)發(fā)射峰形態(tài)與原液基本一致,且在605 nm附近的激發(fā)峰位也無(wú)明顯變化(圖9(b)),說(shuō)明此時(shí)部分亞基內(nèi)部色基的能量傳遞依然在正常生理狀態(tài)．在pH值為6.98條件下,7 d開始熒光發(fā)射峰和激發(fā)峰的形態(tài)即發(fā)生變化(圖9(c)),90 d時(shí)亞基666 nm發(fā)射峰位藍(lán)移至632 nm,激發(fā)峰也藍(lán)移至590 nm附近(圖9(d)),顯然此時(shí)β亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)解體,DBV和PCB色基附近蛋白的微環(huán)境改變．綜上可見β(blue-2)亞基在pH值為4.92時(shí)耐受性最佳．

3 討 論

隱藻借助其特殊的色素成分,組裝形成2套性質(zhì)不同的捕光體系,分別是處于膜上、脂溶性的Chl a/c-蛋白復(fù)合物,和處于膜腔中、水溶性的藻膽蛋白,因而在光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和能量傳遞方式上必然具有特殊性．與紅藻和藍(lán)藻藻膽蛋白相比,隱藻藻膽蛋白不僅在葉綠體中的存在部位迥異、組裝方式不同、亞基的種類和大小也不同[17]．據(jù)報(bào)道,隱藻藻膽蛋白的β亞基由葉綠體基因編碼,可能與紅、藍(lán)藻藻紅蛋白的β亞基同源;而α亞基則是由一組小的核基因家族編碼,不僅分子質(zhì)量只有正常β亞基的一半,且與已知的紅、藍(lán)藻藻膽蛋白各種亞基的序列僅有15%～20%的相同氨基酸殘基,屬于一類特殊的、不同于其他天線多肽的藻膽蛋白類型[18-19]．2種亞基組裝形成的異二聚體作為穩(wěn)定存在的基本單元,是否可進(jìn)一步聚合目前沒有定論,異二聚體與類囊體膜或者葉綠素蛋白復(fù)合物是否相接觸、以哪種亞基接觸也還存在爭(zhēng)議．總體來(lái)說(shuō)目前有關(guān)隱藻藻膽蛋白的報(bào)道相較于研究較為透徹的紅、藍(lán)藻藻膽蛋白要少得多,尤其異二聚體之外的其他存在形式還有待進(jìn)一步研究．

實(shí)驗(yàn)以純化的藍(lán)隱藻(C.plaoidea)PC645為材料,經(jīng)尿素變性拆分后進(jìn)行Sephacryl S-100分子篩層析,分離得到了α和β 2類不同亞基,SDS-PAGE與IEF電泳結(jié)果證實(shí),8 mol/L尿素處理48 h的PC645樣品(A645=10)經(jīng)層析后得到的α與β亞基組分達(dá)到了完全分離的效果．

光譜分析顯示,分離后的α和β亞基依然保持光譜活性,藍(lán)色的β亞基(blue-1和2)在可見光區(qū)吸收主要在600 nm處,而近紫外區(qū)四吡咯基團(tuán)的吸收主峰在360 nm附近,此外還有一個(gè)400～420 nm的肩峰;而純化的α亞基的四吡咯色基吸收主峰位于390～391 nm,在440 nm附近另有一個(gè)較弱的吸收肩峰,見光區(qū)最大吸收峰波長(zhǎng)長(zhǎng)達(dá)640 nm附近,是含有MBV色基而產(chǎn)生的吸收特征．

PC645內(nèi)部只有3種色基,但是這些色基在蛋白內(nèi)部的構(gòu)象、能量傳遞途徑等報(bào)道一直相互矛盾,至今未能完全統(tǒng)一．由于從PC645的α亞基中分離而得的MBV發(fā)色團(tuán)最大吸收峰位于697 nm,因而一度被認(rèn)為是PC645內(nèi)部最低能級(jí)的色基[20];但后期的超快光譜研究認(rèn)為位于β亞基上的PCB (β82)對(duì)應(yīng)于PC645的643 nm處吸收峰,是最低能級(jí)色基,PC645內(nèi)部色基吸收的能量按照DBV→PCB (β158)→PCB (β82)順序傳遞,并產(chǎn)生660～662 nm末端發(fā)射[21]．至于α亞基上的MBV可能接受來(lái)自DBV的激發(fā)能,并傳遞給PCB (β158)色基[22],但也有報(bào)道MBV不能接受DBV的能量,且只能將激發(fā)能傳遞給PCB (β82)[23]．實(shí)驗(yàn)純化的β亞基在580 nm激發(fā)光下產(chǎn)生660 nm熒光,而純化后的α亞基(green-2)沒有末端熒光發(fā)射,只有4 mol/L尿素變性不完全而沾染了β亞基(grren-1)的情況下才能觀察到660 nm熒光,這一結(jié)果說(shuō)明α亞基上的MBV吸收的能量需要傳遞給β亞基才能產(chǎn)生末端發(fā)射,為β亞基是PC645的末端發(fā)射位點(diǎn)提供了直接證據(jù)．

blue-1、2組分均被發(fā)現(xiàn)含有2種分子質(zhì)量(17.8 kU/15.9 kU)和等電點(diǎn)(pI 6.0/5.7)不同的熒光條帶,說(shuō)明PC645存在2種β亞基,其中β2亞基與實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)PC645的報(bào)道相一致[11],但其他的實(shí)驗(yàn)室未有報(bào)道．

蛋白質(zhì)以及亞基的空間折疊狀態(tài)受多方面因素的影響,包括pH值、離子強(qiáng)度、保存濃度等．隱藻藻膽蛋白處于類囊體腔內(nèi),伴隨著光合作用的光反應(yīng)的進(jìn)行,質(zhì)子泵工作的結(jié)果將使腔內(nèi)的pH值從pH=7的正常生理?xiàng)l件逐步酸化,因此pH值對(duì)PC645的狀態(tài)影響將是重要因素．前期實(shí)驗(yàn)室的工作結(jié)果顯示,PC645異二聚體可在pH值為3～10范圍內(nèi)保持穩(wěn)定或變性可逆性,并且pH值為4～7的酸性條件有利于隱藻PC645的活性狀態(tài)．實(shí)驗(yàn)通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)拆分后的亞基在不同的酸性pH條件下保存后的吸收以及熒光光譜的變化,發(fā)現(xiàn)α與β亞基的最佳pH儲(chǔ)存條件分別為6.98和4.92,時(shí)間在一周內(nèi)為佳,在45 d以內(nèi)可以維持基本活性．顯然拆分后亞基的pH耐受范圍與異二聚體并不完全一致,可能與2種亞基各自的酸堿性或等電點(diǎn)不同有關(guān)．上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)現(xiàn)了對(duì)隱藻活性亞基的大規(guī)模分離,為今后亞基序列分析以及亞基的基本結(jié)構(gòu)與能量傳遞功能關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)．