劉 暉 張嘉偉 林 宇 王秀清 趙旭偉 (齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161042)

研究表明腦缺血-再灌注損傷可引起嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，而銀杏葉提取物主要活性成分銀杏內(nèi)酯B對(duì)腦缺血/再灌注后腦組織具有保護(hù)作用〔1〕。尼莫地平對(duì)腦缺血-再灌注腦損傷有明確的保護(hù)作用〔2，3〕。本實(shí)驗(yàn)觀察銀杏內(nèi)酯B對(duì)腦損傷腦組織含水量及炎癥因子和相關(guān)細(xì)胞黏附分子表達(dá)水平的影響，探討其治療缺血性腦血管病炎癥修復(fù)的效果。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 60只SD老齡大鼠，雌雄各半，體重400～650g，鼠齡20～22月齡。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平(4 mg/kg)組和銀杏內(nèi)酯 B(2.5、5.0、10mg/kg)治療組，每組10只。

1.2 藥物與試劑 水合氯醛(中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司);尼莫地平注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):120731);銀杏內(nèi)酯B(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào):101201);其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、E-選擇素(E-selectin)試劑盒(美國(guó)TBI公司，批號(hào):20110501);白介素(IL)-6、IL-1β放免試劑盒(上海海軍醫(yī)學(xué)工程研究所，批號(hào):20121006);TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物公司，批號(hào):20110906)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 假手術(shù)組和模型組只注射等體積的生理鹽水，尼莫地平和銀杏內(nèi)酯B組分別注射相應(yīng)劑量的藥物，各組動(dòng)物舌下靜脈注射給藥，1次/d，連續(xù)3 d，最后一次給藥1 h后，采用Longa法制作老齡大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型〔4〕。老齡大鼠腹腔注射乙醚麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)，行頸部正中縱行切口，行氣管插管，小心分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，避免傷及迷走神經(jīng)，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)動(dòng)脈和基底動(dòng)脈30 min，然后松開(kāi)動(dòng)脈夾使血流再通，即復(fù)制出腦缺血再灌注模型。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不夾閉。無(wú)菌縫合后回籠飼養(yǎng)。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目 干濕法測(cè)定腦組織含水量:處死老齡大鼠，快速斷頭取腦。將大腦半球用濾紙吸去表面殘血，稱濕重后置105℃烘箱烤干至恒重，再秤干重，計(jì)算腦組織含水量。腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%〔5〕。

缺血再灌注72 h后斷頭取腦。用冷PBS沖洗3次，濾紙吸干，用冷的生理鹽水配成10%腦組織勻漿，勻漿液4℃最大速度離心10 min，取上清液，用ELISA試劑盒分別測(cè)定腦組織中ICAM-1、E-selectin和TNF-α的表達(dá)水平。

血清IL-6、IL-1β含量測(cè)定:缺血再灌注72 h后，取靜脈血3 ml，3 000 r/min離心5 min后取上清，按照RIA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 銀杏內(nèi)酯B對(duì)老齡大鼠腦組織含水量的影響 腦缺血再灌注后，模型組老齡大鼠的腦組織含水量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，經(jīng)過(guò)陽(yáng)性對(duì)照藥物尼莫地平處理后腦組織含水量顯著降低(P＜0.01)，銀杏內(nèi)酯B各劑量組可降低缺血再灌注后老齡大鼠的腦組織含水量，且具有濃度依賴性，含水量隨給藥濃度的升高呈降低趨勢(shì)(P＜0.01或P＜0.05)，最高劑量組(10.0 mg/kg)含水量的降低程度最顯著，較尼莫地平組降低腦水腫能力更顯著。見(jiàn)表1。

2.2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)腦缺血再灌注老齡大鼠腦組織ICAM-1和E-selectin表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組ICAM-1和E-selectin的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01);銀杏內(nèi)酯B組和尼莫地平組ICAM-1和E-selectin的表達(dá)水平均不同程度降低(P＜0.01或P＜0.05)，且呈明顯劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。見(jiàn)表1。

2.3 銀杏內(nèi)酯B對(duì)腦缺血再灌注老齡大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組 IL-6、IL-1β和TNF-α的含量顯著升高(P＜0.01);銀杏內(nèi)酯B組和尼莫地平組IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均不同程度降低(P＜0.01或P＜0.05)，且呈明顯劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。見(jiàn)表1。

表2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)腦缺血再灌注老齡大鼠腦組織含水量、ICAM-1、E-selectin表達(dá)水平及血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影響(±s，n=10)

表2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)腦缺血再灌注老齡大鼠腦組織含水量、ICAM-1、E-selectin表達(dá)水平及血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影響(±s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 劑量(mg/kg)腦組織含水量(%)ICAM-1(ng/ml)E-selectin/(ng/ml) IL-6/(ng/L) IL-1β/(ng/L) TNF-α(mg/g)假手術(shù)組 - 75.84±1.162) 0.86±0.192) 12.49±3.172) 97.12±16.712) 137.48±21.492) 0.41±0.072)模型組 - 85.12±2.31 1.49±0.53 20.67±6.37 197.18±21.58 287.27±31.29 1.49±0.71尼莫地平組 4.0 79.18±1.492) 0.97±0.372) 10.19±5.072) 124±16.492) 149.17±19.782) 0.57±0.462)銀杏內(nèi)酯B 2.5 81.21±2.181) 1.29±0.371) 14.34±4.971) 179.25±12.491) 197.28±14.191) 1.07±0.621)銀杏內(nèi)酯B 5.0 80.12±1.461) 1.28±0.441) 12.04±3.711) 159.28±12.791) 164.47±13.291) 0.72±0.241)銀杏內(nèi)酯B 10.0 78.94±1.212) 1.01±0.232) 10.18±2.492) 132.19±21.482) 148.19±20.072) 0.61±0.492)

3 討論

腦缺血-再灌注損傷引起的腦血管病是臨床常見(jiàn)的致死性疾病之一，尤其對(duì)高齡患者而言，危害極大，致死率、致殘率極高〔6，7〕。腦缺血-再灌注過(guò)程作用機(jī)制復(fù)雜，主要通過(guò)興奮性氨基酸、氧自由基、細(xì)胞因子等刺激與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)，包括 TNF-α、IL-6、IL-1β、E-selectin、ICAM-1 等，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附及遷移，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。但是過(guò)度的炎癥反應(yīng)不僅影響局部的血液供應(yīng)，而且可以直接破壞組織結(jié)構(gòu)，加重腦損害及腦水腫癥狀，從而造成腦組織損傷。

本實(shí)驗(yàn)中給老齡大鼠構(gòu)建腦缺血-再灌注模型后，缺血區(qū)腦組織發(fā)生明顯壞死，模型組動(dòng)物腦組織含水量顯著增高，預(yù)示腦水腫的發(fā)生，同時(shí)組織中E-selectin、ICAM-1的表達(dá)水平和血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量顯著增高;通過(guò)預(yù)先給予不同劑量的銀杏內(nèi)酯B處理3 d，能顯著減輕腦水腫癥狀，減少腦缺血-再灌注后炎癥介質(zhì)的釋放，表明銀杏內(nèi)酯B在減輕腦缺血組織的炎癥反應(yīng)上具有顯著效果，其效果與尼莫地平具有比較性，可以說(shuō)明其是治療腦血管疾病、減輕缺血性腦損傷炎癥反應(yīng)的潛在藥物〔8，9〕，但其作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。

1 Gu JH，Ge JB，Li M，et al.Inhibition of NF-kappa B activation is associated with anti-inflammatory and anti-apoptotic effects of Ginkgolide B in a mouse model of cerebral ischemia/reperfusion injury〔J〕.Eur J Pharm Sci，2012;47(4):652-60.

2 趙士弟，黃 麗，姜之全，等.金雀異黃酮預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠小腦浦肯野細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012;32(13):2758-60.

3 樂(lè)樂(lè)樂(lè)，董 志.利莫那班對(duì)局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;31(12):2226-8.

4 Huang MH，Qian YS，Guan T，et al.Different neuroprotective responses of Ginkgolide B and bilobalide，the two Ginkgo components，in ischemic rats with hyperglycemia〔J〕.Eur J Pharmacol，2012;677(1-3):71-6.

5 Ma SW，Yin HF，Chen LY，et al.Neuroprotective effect of ginkgolide K against acute ischemic stroke on middle cerebral ischemia occlusion in rats〔J〕.J Nat Med-Tokyo，2012;66(1):25-31.

6 Yang ZZ，Li J，Li SX，et al.Effect of ginkgolide B on striatal extracellular amino acids in middle cerebral artery occluded rats〔J〕.J Ethnopharmacol，2011;136(1):117-22.

7 Fang WR，Deng Y，Li YM，et al.Blood brain barrier permeability and therapeutic time window of Ginkgolide B in ischemia-reperfusion injury〔J〕.Eur J Pharm Sci，2010;39(1-3):8-14.

8 Wang JT，Jiang SY，Kwong JMK，et al.Nuclear factor-kappa B p65 and upregulation of interleukin-6 in retinal ischemia/reperfusion injury in rats〔J〕.Brain Res，2006;1081:211-8.

9 金 晶，董宇翔，李 戈.銀杏葉提取物在老年性疾病治療中的應(yīng)用進(jìn)展〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2007;27(6):596-8.