林清霞，鄭德勇，2*

(1．福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院，福建 福州 350002;2．福建農(nóng)林大學(xué)茶葉科技與經(jīng)濟(jì)研究所，福建 福州 350002)

植物中皂苷類物質(zhì)常具有獨(dú)特的生物活性，近年來對人參［1］、絞股藍(lán)、百合［2－3］和文冠果［4］等原料中皂苷類物質(zhì)進(jìn)行了較深入的研究，開發(fā)出許多皂苷類藥物;從資源豐富的油茶籽［5］提取分離的皂苷已開始用于配制洗發(fā)香波等洗滌類產(chǎn)品［6］。無患子在我國淮河流域以南和廣東、福建、臺灣、廣西、云南等地［7］有廣泛分布，無患子假種皮中含有豐富的無患子皂苷，主要包括以常春藤皂苷元(hederagenin)為基本骨架的三萜類皂苷及一些倍半萜皂苷［8－9］，它們均具有很強(qiáng)的表面活性作用，是一類天然的非離子型表面活性劑［10］，Huang等［11］還發(fā)現(xiàn)從無患子果肉中分離的三萜皂苷具有抗癌等多種功效，近年研究還表明無患子皂苷對重金屬具有廣譜的洗脫作用［12］。

無患子皂苷的分離與純化是無患子皂苷資源的開發(fā)利用基礎(chǔ)，目前一般采用萃取法、膜分離法、大孔樹脂法等［13］。饒厚曾等［14］分別用正丁醇和乙醚萃取提純皂苷和皂苷元，但這一工藝溶劑量耗費(fèi)較大，并且所得皂苷產(chǎn)率及純度不高;魏鳳玉等［15－16］采用水提－大孔樹脂吸附分離法及超濾法對無患子皂苷進(jìn)行分離純化，總皂苷純度可分別達(dá)85%、67%，但仍存在著成本高、周期長等問題。泡沫分離法與上述分離方法相比無需使用大量有機(jī)溶劑，運(yùn)行成本較低，在蛋白質(zhì)分離［17］上的應(yīng)用比較成熟，近年來在分離人參皂苷［18］、三七皂苷［19］等天然皂苷類中也取得了較好的成效。本研究嘗試將泡沫分離法應(yīng)用于無患子皂苷的分離。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 原料、試劑和儀器

無患子假種皮由福建省大青實(shí)業(yè)有限公司提供，經(jīng)日曬、風(fēng)干備用。試驗(yàn)中除高效液相色譜分析所用甲醇為HPLC級之外，其余試劑均為分析純。

UV－2800AH紫外分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;高效液相色譜(1200 series)，美國安捷倫公司。自制泡沫分離裝置:由泡沫分離柱、空氣泵、氣體分布器、轉(zhuǎn)子流量計(LZB－4，燕山儀表總廠)、恒溫循環(huán)器(HX－1050，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)等組裝。其中泡沫分離柱為玻璃管制成，高600 mm，直徑40 mm。由分離柱底部通入空氣，分離柱外部有直徑60 mm夾套，可通入循環(huán)水，以控制分離溫度。

1．2 試驗(yàn)原料液制備

無患子濃縮液:2 000 g無患子假種皮經(jīng)清水洗滌、瀝干后，每次加入10 L 60% 乙醇，浸提3次，合并濾液，濃縮至3 L。加入9 L 95% 乙醇溶液進(jìn)行醇沉，于陰涼處靜置過夜，濾去多糖等沉淀物。濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)，回收乙醇，即得無患子濃縮液。經(jīng)檢測，其含固形物為45．30%。

1．3 無患子總皂苷含量的測定

1．3．1 無患子總皂苷測定條件的優(yōu)化 稱取自制的無患子皂苷標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，取100 μL該溶液于試管中，并置于水浴中揮干溶劑。分別加入顯色劑與氧化劑，待顯色完全后用紫外分光光度測定其吸光度。參照魏鳳玉等［20］選取顯色劑為香草醛、氧化劑為高氯酸。改變所加入的5%香草醛與高氯酸的比例及反應(yīng)時間，將顯色樣品于400～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，對比不同紫外光圖譜，獲得測定無患子皂苷的最佳條件為:分別加入0．4 mL 5% 的香草醛和1．2 mL高氯酸試劑，搖勻后置于70℃ 的水浴中加熱20 min，再冰浴3 min，最后加入5 mL冰醋酸搖勻，采用紫外分光光度計在481 nm波長下測定皂苷含量。

1．3．2 無患子總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取12．4 mg無患子皂苷純品于10mL容量瓶中用甲醇定容。分別吸取該標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、200、300、400和500 μL于試管中，并置于水浴中揮干溶劑，采用上述優(yōu)化方法測定紫外吸光度。

1．4 泡沫分離法純化無患子皂苷試驗(yàn)

在一定的進(jìn)料濃度、進(jìn)料量、pH值和分離氣速、溫度的情況下，采用自制的泡沫分離裝置進(jìn)行泡沫分離操作，收集塔頂溢出的泡沫，采用攪拌法消泡，用量筒測量泡沫液的體積，并測定其固形物、總皂苷。分離效果通過收率、富集比以及純度進(jìn)行表征。計算公式如下:

式中:Y—總皂苷收率，%;Cf—泡沫液中總皂苷質(zhì)量濃度，g/L;Vf—泡沫液體積，mL;Ci—進(jìn)料液總皂苷質(zhì)量濃度，g/L;Vi—進(jìn)料量，mL。

式中:E—總皂苷富集比;Cf—泡沫液總皂苷質(zhì)量濃度，g/L;Ci—進(jìn)料液皂苷質(zhì)量濃度，g/L。

式中:P—總皂苷純度，%;Cf—泡沫液總皂苷質(zhì)量濃度，g/L;Vf—泡沫液體積，mL;Wf—收集液烘干后所得固體的質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2．1 無患子總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用1．3節(jié)方法測定無患子總皂苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以溶液中無患子總皂苷質(zhì)量為自變量(X，mg)，以測試液吸光度(Y)為因變量，可得到無患子總皂苷含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=3．577X+0．01(R2=0．999 4)。

2．2 泡沫分離純化條件對分離效果的影響

2．2．1 進(jìn)料量的影響 在進(jìn)料濃度2．0 g/L、料液pH值4．3、氣速32 L/h、溫度40℃ 條件下，改變進(jìn)料量(50、100、150、200和250 mL)進(jìn)行泡沫分離操作，結(jié)果如圖1。

由圖1可知，收率隨著進(jìn)料量的增加呈現(xiàn)上升趨勢，富集比隨著進(jìn)料量的增加呈下降趨勢，而泡沫中皂苷的純度在這過程中變化不大。這是因?yàn)殡S著進(jìn)料量的增大，鼓泡區(qū)變大，相應(yīng)的泡沫分離區(qū)就小了，泡沫中更多的夾帶液在回流前被收集，因此收率增大。另外，由于進(jìn)料量的增加，液體回流時間減少，使得更多的泡沫夾帶液被收集，則富集比呈現(xiàn)下降的趨勢。綜合以上3個指標(biāo)可見，當(dāng)進(jìn)料量在150 mL左右時，泡沫分離效果較好。

2．2．2 初始進(jìn)料濃度的影響 在進(jìn)料量150 mL、料液pH值4．3、氣速32 L/h、溫度40℃ 條件下，改變進(jìn)料濃度(1．0、2．0、3．0、4．0 和5．0 g/L)進(jìn)行泡沫分離操作，結(jié)果如圖2。

圖1 進(jìn)料量對泡沫分離效果的影響Fig．1 The effect of the initial solution volume on foam separation

圖2 進(jìn)料濃度對泡沫分離效果的影響Fig．2 The effect of the initial concentration of saponin on foam separation

由圖2可知，無患子總皂苷收率及富集比隨著進(jìn)料濃度的增加都呈現(xiàn)下降趨勢，收率在初始濃度為3．0 g/L之前下降得比較緩慢，之后急速下降。而富集比在初始濃度為3．0 g/L之前下降得較快，之后趨于平衡。泡沫中皂苷的純度則隨進(jìn)料濃度的增大呈緩慢下降趨勢。這是由于在進(jìn)料濃度低時，泡沫較不穩(wěn)定、易破裂，泡沫中夾帶液的量相對較少，因此富集比與純度都較高。收率隨著進(jìn)料濃度的增大也是整體呈下降變化，可能是實(shí)驗(yàn)中所用的鼓泡器的孔徑比較大，不利于高濃度溶液的分離并且由于實(shí)驗(yàn)中的皂苷濃度超過臨界膠束濃度［10］(無患子皂苷在25℃ 時的臨界膠束濃度cmc為33 mg/L)，皂苷分子在氣液界面處無法通過吸附原理富集，使得夾帶液在泡沫液中增加的速度大于皂苷增加的速度，因此收率減小。綜合可知當(dāng)進(jìn)料量濃度在2．0 g/L左右時，泡沫分離效果較好。

2．2．3 氣速的影響 在進(jìn)料量150 mL、濃度2．0 g/L、料液 pH 值4．3、溫度40℃ 條件下，改變分離氣速(16、24、32、40和48 L/h)進(jìn)行泡沫分離操作，結(jié)果如圖3。

由圖3可知，皂苷收率隨著氣速的增大呈現(xiàn)上升趨勢，富集比和純度隨氣速增大呈下降趨勢。這是由于氣速較低時泡沫到達(dá)管頂端的時間延長、回流時間增加，即分離區(qū)變大了，使得泡沫液中的夾帶液減少，導(dǎo)致收率較低、富集比較高、純度較高。當(dāng)氣速介于24～32 L/h時，收率增加得相對較快，此時富集比與純度都稍微增大。這可能是由于該過程泡沫夾帶液增加的速率小于皂苷增加的速率，因此富集比與純度反而增加了。綜合以上指標(biāo)可得，當(dāng)氣速介于24～32 L/h范圍內(nèi)，有較好的分離效果。

2．2．4 溫度的影響 在進(jìn)料量150 mL、濃度2．0 g/L、料液pH值4．3、氣速32 L/h條件下，改變分離溫度(5、10、20、30、40、50和60℃)進(jìn)行泡沫分離操作，結(jié)果如圖4。

由圖4可知，無患子皂苷的富集比、收率以及純度都在30℃ 時達(dá)到最大。在30℃ 之前，三者都呈上升變化。在30℃ 之后，都大體呈下降變化。而在20～40℃ 范圍內(nèi)變化得最為明顯。這是由于無患子皂苷在25～40℃［8］附近時表面活性穩(wěn)定，過高或過低的溫度都不利于泡沫的穩(wěn)定性，因此分離效果也會受影響?？梢?，維持溫度為30～40℃ 左右時，泡沫分離效果較好。

圖3 氣速對泡沫分離效果的影響Fig．3 The effect of the gas flow rate on foam separation

圖4 溫度對泡沫分離效果的影響Fig．4 The effect of the solution temperature on foam separation

2．2．5 pH 值的影響 在進(jìn)料量150 mL、濃度 2．0 g/L、氣速 32 L/h、溫度 40 ℃ 條件下，改變 pH 值(3．5、4．3、6、7、8、9)進(jìn)行泡沫分離操作，結(jié)果如圖5。

由圖5可知，在酸性條件下皂苷收率隨著pH值上升呈上升趨勢，當(dāng)pH值超過6以后收率呈下降變化，即在酸性條件下皂苷的收率高于堿性條件。這是由于無患子是一種天然弱酸性表面活性劑，在酸性條件下所形成的泡沫更加穩(wěn)定。皂苷的富集比在pH值為8以前整體變化不大，在pH值為8～9時富集出現(xiàn)大幅度變化，可能是堿性太強(qiáng)，泡沫破碎得比較快，因此夾帶液很少，加之分離管的管徑相對較小，破碎的泡沫更容易分出，使得富集比較高。但pH值對富集比和純度的影響均較小。綜合以上變化趨勢，考慮到無患子皂苷是一種弱酸性表面活性劑，因此pH值為4～6范圍內(nèi)分離效果較好。

綜上所述，當(dāng)進(jìn)料濃度為2．0 g/L左右、進(jìn)料量為150 mL左右、氣速在24～32 L/h之間、溫度范圍30～40℃、pH值為4～6時，無患子皂苷的泡沫分離效果較好。

2．3 重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)

在進(jìn)料濃度2．0 g/L、進(jìn)料量150 mL、氣速32 L/h、溫度30℃、pH值為4．3條件下，進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

圖5 pH值對泡沫分離效果的影響Fig．5 The effect of solution pH values on foam separation

表1 重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果Table 1 The results of verification test

由表1可知，富集比、收率、純度的RSD分別為1．29%、1．36% 和2．24%，表明以上試驗(yàn)的重現(xiàn)性良好。當(dāng)進(jìn)料濃度2．0 g/L、進(jìn)料量150 mL、氣速32 L/h、溫度30℃、pH值4．3條件下，富集比可達(dá)到2．153，收率與純度分別達(dá)到79．19% 和74．68%。

3 結(jié)論

3．1 進(jìn)料濃度、進(jìn)料量、氣速、pH值和溫度等工藝因子對泡沫分離效果均有顯著影響。無患子皂苷的收率隨進(jìn)料濃度的增大而降低，而隨氣速、進(jìn)料量的增大而提高，且在酸性條件以及溫度為30～40℃范圍內(nèi)收率較高。無患子皂苷的富集比隨進(jìn)料濃度、氣速、進(jìn)料量的增大而降低，且在溫度為30～40℃范圍內(nèi)富集比較高，受pH值的影響相對較小。無患子皂苷的純度隨進(jìn)料濃度、氣速的增大而降低，且在溫度為30～40℃ 范圍內(nèi)純度較高，隨進(jìn)料量及pH值的影響較小。

3．2 泡沫分離法可以較好地解決皂苷提取過程中純度低等問題，分離過程工藝穩(wěn)定、分離效果好。在進(jìn)料濃度2．0 g/L、進(jìn)料量150 mL、氣速32 L/h、溫度30℃、pH 值4．3條件下，富集比可達(dá)到2．153，收率與純度分別達(dá)到79．19% 和74．68%。

［1］高彩霞，王成章．人參皂苷的提取和精制工藝研究［J］．林產(chǎn)化工通訊，2005，39(5):5－8．

［2］吉宏武，丁霄霖．百合皂苷的提取分離與結(jié)構(gòu)初步鑒定［J］．林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2001，21(3):47－51．

［3］吉宏武，丁霄霖．百合總皂苷定量測定方法的研究［J］．林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2003，23(4):54－58．

［4］吳偉杰，李博生．泡沫分離法提取文冠果果皮皂苷的工藝條件［J］．浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(4):816－819．

［5］曾韜，畢夢宇，李尤山，等．茶皂素的提取研究［J］．林產(chǎn)化工通訊，2000，34(6):16－18．

［6］陳 欽，鄭清芳．油茶餅綜合利用的研究［J］．福建林學(xué)院學(xué)報，2000，20(2):140－143．

［7］中國植物志編輯委員會．中國植物志四十七卷(第1分冊)［M］．北京:科學(xué)出版社，1998．

［8］KIMATA H，NAKASHIMA T，KOKUBUN S，et al．Saponins of pericarps of Sapindus mukorossi Gaertn and solubilization of monodesmosides by bisdesmosides［J］．Chem Pharm Bull，1983，31(6):1998－2005．

［9］HUANG H C，TSAI W J，MORRIS-NATSCHKE S L，et al．Sapinmusaponins F-J bioactive tirucallane—type saponins from the galls of Sapindus mukorossi［J］．J Nat Prod，2006，69(5):763－767．

［10］孫潔如，陳孔常，周鳴方．無患子表面活性物及其復(fù)配體系的性質(zhì)研究［J］．日用化學(xué)工業(yè)，2002，32(4):16－18．

［11］HUANG H C，WU M D，TSAI W J，et a1．Triterpenoid saponins from the fruits and galls of Sapindus mukorossi［J］．Phytochemistry，2008，69(7):1609－1616．

［12］周仁，甘荔，陳福明，等．無患子洗滌劑清除體表金屬毒物效果的研究［J］．職業(yè)醫(yī)學(xué)，1991，18(6):330－331．

［13］黃素梅，王敬文，杜孟浩，等．無患子的研究現(xiàn)狀及其開發(fā)利用［J］．林業(yè)科技開發(fā)，2009，23(6):1－4．

［14］饒厚曾，郭隆華．無患子皂苷提取工藝研究［J］．江西科學(xué)，2002，20(3):55－58．

［15］魏鳳玉，余錦城，解輝．天然無患子皂苷的提取分離［J］．安徽化工，2007，33(3):15－17．

［16］魏鳳玉，解輝，余錦城，等．超濾法分離提純無患子皂苷［J］．膜科學(xué)與技術(shù)，2008，28(2):85－88．

［17］BHATTACHARJEE S，KUMAR R，GANDHI K S．Prediction of separation factor in foam separation of proteins［J］．Chemical Engineering Science，1997，52(24):4625－4636．

［18］修志龍，張代佳，賈凌云，等．泡沫分離法分離人參皂苷［J］．過程工程學(xué)報，2001，1(3):289－292．

［19］張雁，宋建國，魚紅閃，等．三七皂苷 R1 的分離提純［J］．大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，30(3):161－164．

［20］魏風(fēng)玉，張靜，解輝．無患子總皂苷含量的測定［J］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20:81－83，102．