張 卉
(沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110142)
自從20世紀(jì)70年代真菌多糖抑制腫瘤的活性被發(fā)現(xiàn)以來,真菌多糖一直是生物化學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和食品科學(xué)等學(xué)科的一個(gè)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[1-2]。但由于真菌多糖是極其復(fù)雜的多聚體,來自不同真菌的多糖即使具有相同的單糖組成,其理化性質(zhì)、生物活性也可能差別很大。目前已發(fā)現(xiàn)真菌多糖的生物活性與其精細(xì)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象有關(guān),但在多糖構(gòu)效關(guān)系等方面仍有許多問題有待闡明[3]。
姬松茸(AgaricusblazeiMurr.)是一種珍貴的食藥兼用真菌。20世紀(jì)80年代開始,因發(fā)現(xiàn)姬松茸子實(shí)體多糖具有免疫力調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗氧化等功效而受到廣泛關(guān)注[4-5]。由于栽培條件要求高等因素,姬松茸子實(shí)體供應(yīng)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。隨著研究的深入,研究者發(fā)現(xiàn)采用液態(tài)深層發(fā)酵替代固態(tài)栽培產(chǎn)生的姬松茸菌絲體和發(fā)酵液中也含有豐富的活性多糖成分[6-8],而且該法可實(shí)現(xiàn)姬松茸菌絲體和發(fā)酵液的工廠化周年生產(chǎn),為真菌生物活性多糖的來源開辟了新途徑。
本項(xiàng)目對(duì)姬松茸液態(tài)深層發(fā)酵液中的胞外多糖的結(jié)構(gòu)及其動(dòng)物體內(nèi)對(duì)免疫器官的影響和抗腫瘤活性進(jìn)行了研究,以探索多糖的構(gòu)效關(guān)系,為更好地開發(fā)和利用姬松茸多糖奠定基礎(chǔ)。
真菌多糖AbEXP1a:由真菌姬松茸發(fā)酵液經(jīng)冷乙醇沉淀,Sevag法脫蛋白8~12次,H2O2脫色、透析、DEAE-纖維素柱層析和Sephadex G-200凝膠過濾獲得[9]。
S-180實(shí)體腫瘤:由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明種小鼠,體重18~20g,40只,雌雄各半,購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。
高效液相色譜儀,Waters 510型;傅里葉變換紅外光譜儀,NIGOLT 550型;核磁共振儀,Bruker AVANCE 500。
1.3.1 單糖組分分析
稱取純化多糖20.0mg,溶解于4mL濃度為2mol/L 硫酸中,封管,105 ℃ 水 解8h[10-11]。切開封管,水解液BaCO3中和,在4℃、10 000g條件下離心5min,所得上清液經(jīng)真空濃縮,采用HPLC法分析其單糖組分。HPLC色譜條件:Sugar Pak-1柱(30cm×5.9cm),柱溫70℃,流動(dòng)相為1mmol/L EDTA 二鈉鈣,體積流量0.4mL/min,示差折光檢測(cè)器檢測(cè)[12]。
1.3.2 紅外光譜分析
KBr壓片法:取干燥樣品2mg左右,KBr壓片,400~4 000cm-1掃描[13]。
1.3.3 核磁共振分析
將多糖AbEXP1a溶解于D2O,進(jìn)行13C和1H核磁共振分析.
小鼠常規(guī)接種S-180實(shí)體瘤,次日隨機(jī)分組,每組10只。給藥組分別按照5、10和20mg/(kg·d)劑量進(jìn)行腹腔注射多糖,每日1次,連續(xù)給藥10d。對(duì)照組給予等量的生理鹽水。末次給藥后的次日,眼眶放血處死小鼠,稱體重,再剝?nèi)∑⑴K、胸腺稱重,計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù),比較與對(duì)照組的差異顯著性;剖取瘤塊稱重并計(jì)算抑瘤率[14-15]。
2.1.1 AbEXP1a的單糖組成
圖1中2個(gè)峰的保留時(shí)間分別為11.936和13.422min,與相同色譜條件下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間(11.938min)和甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間(13.534min)基本相同,表明AbEXP1a含有葡萄糖和甘露糖2種單糖組分。兩峰的峰面積比約為3∶1,表明多糖AbEXP1a分子中葡萄糖和甘露糖的比例為3∶1。
2.1.2 AbEXP1a的紅外光譜分析結(jié)果
多糖AbEXP1a的紅外光譜見圖2。根據(jù)《Sadtler Reference Spectra Collection》中多糖的標(biāo)準(zhǔn)譜圖及有關(guān)資料對(duì)圖2進(jìn)行分析,結(jié)果如下:在3 406.75cm-1處有O—H鍵的伸縮振動(dòng)的強(qiáng)寬吸收峰,表明多糖AbEXP1a分子中有大量氫鍵;在2 929.50cm-1處有糖環(huán)上C—H鍵的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰,表明分子中有C—H結(jié)構(gòu);在1 647.38和1 422.66cm-1處是多糖類物質(zhì)的特征吸收峰;在1 149~1 017cm-1是糖環(huán)上C—O鍵的吸收峰;在810cm-1處是甘露糖的特征吸收峰;在749.99cm-1處是吡喃環(huán)的特征吸收峰;在416.56cm-1處的是吡喃環(huán)碳骨架強(qiáng)吸收峰。在930~950cm-1無吸收峰,而在890和850cm-1處有吸收峰,表明分子中存在α型和β型糖苷鍵,且根據(jù)吸收峰的強(qiáng)弱可知該多糖分子中以β型糖苷鍵為主[16-18]。
圖2 多糖AbEXP1a的紅外光譜圖Fig.2 IR spectrum of AbEXP1a
2.1.3 AbEXP1a的核磁共振分析結(jié)果
圖3為AbEXP1a的1H-NMR譜圖,由圖3可見,共振信號(hào)的主要化學(xué)位移小于5.0,表明該多糖分子中以β型糖苷鍵為主。而化學(xué)位移大于5.0處也有吸收峰,表明其分子中也含有α型糖苷鍵?;瘜W(xué)位移在4.95和5.2~5.4處有吸收峰,表明該多糖分子中有葡萄糖和甘露糖。
圖3 AbEXP1a的1 H-NMR譜圖Fig.3 1 H-NMR spectrum of AbEXP1a
圖4為AbEXP1a的13C-NMR譜圖,由圖4可見,δ為100.3、101.9處有吸收峰,表明分子中含有葡萄糖和甘露糖;δ為86.52附近無吸收峰,表明無C3取代;δ在70~78范圍內(nèi)有吸收峰,表明無C4取代;δ在60.6、60.0附近有吸收峰,且δ在68.8處有吸收峰,表明其分子中有部分C6被取代。此外,在82~84及103~112均無信號(hào),表明糖環(huán)非呋喃糖型,而是吡喃型[19]。
圖4 AbEXP1a的13C-NMR譜圖Fig.4 13 C-NMR spectrum of AbEXP1a
綜合以上結(jié)果,推測(cè)多糖AbEXP1a分子由葡萄糖和甘露糖構(gòu)成,二者的比例為3∶1,其主鏈由3個(gè)吡喃葡萄糖分子通過β-(1→6)糖苷鍵連接,再以α-(1→6)或β-(1→6)與吡喃甘露糖連接。
多糖AbEXP1a對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響及對(duì)小鼠移植腫瘤的作用見表1。由表1可見,各受試組小鼠的體重與對(duì)照組相比無顯著性差異。3種劑量的胞外多糖均對(duì)小鼠的脾指數(shù)有顯著影響,但只有較高濃度組對(duì)于胸腺指數(shù)才有顯著影響。與對(duì)照相比,三劑量組對(duì)小鼠S-180移植腫瘤的抑制率均有顯著性差異,但中高劑量組之間的腫瘤抑制率沒有顯著差別。10mg/mL劑量對(duì)S-180移植腫瘤的抑制率可達(dá)64.04%。
表1 多糖AbEXP1a對(duì)小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和移植腫瘤的抑制作用(ip)Tab.1 Influence of polysaccharide AbEXP1aon spleen index,thymus index and transplantation tumor inhibition effect in mice(ip)
姬松茸胞外多糖AbEXP1a由葡萄糖和甘露糖構(gòu)成,二者的比例為3∶1。AbEXP1a分子的主鏈由3個(gè)連續(xù)的吡喃型葡萄糖分子通過β-(1→6)糖苷鍵連接,再通過α-(1→6)或β-(1→6)糖苷鍵與吡喃型甘露糖連接而成。
多糖AbEXP1a具有提高小鼠免疫器官質(zhì)量指數(shù),即提高小鼠機(jī)體免疫作用,還具有抗腫瘤作用。
關(guān)于真菌多糖的結(jié)構(gòu)與功效之間的關(guān)系一直是糖生物學(xué)研究的主要方向之一,比較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為多糖鏈連接鍵的類型、多糖的相對(duì)分子質(zhì)量和立體結(jié)構(gòu)對(duì)生物活性有重要影響,但是至今尚未有突破。
多糖主鏈的構(gòu)型是決定其功效的關(guān)鍵因素之一。一般認(rèn)為以β-(1→3)糖苷鍵或β-(1→6)糖苷鍵構(gòu)成主鏈的真菌多糖大多具有抗腫瘤、免疫增強(qiáng)等生物活性[20]。對(duì)β-(1→3)葡聚糖的研究表明,此種構(gòu)型有利于形成螺旋狀結(jié)構(gòu),具有較高的生物活性和抗腫瘤活性。對(duì)香菇多糖、云芝多糖、灰樹花多糖、金針菇多糖和蟲草多糖等[21-23]的結(jié)構(gòu)分析都符合這一規(guī)律。本文研究的姬松茸多糖具有β-(1→6)糖苷鍵,為其抗腫瘤等生物活性提供了結(jié)構(gòu)上的依據(jù)。
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