胡 曦 予，崔 勵，馮 魁

(大連工業(yè)大學 輕工與化學工程學院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

甾體類藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，隨著需求量的不斷增大，合成甾體類藥物的反應技術得到越來越廣泛和深入的研究[1]。與傳統(tǒng)化學合成方法相比，微生物轉化反應污染低、能耗低、特異性高，且具有轉化步驟簡單、轉化類型豐富等諸多優(yōu)點[2]，因此人們逐漸將目光投向甾體微生物轉化技術。

雄甾－4－烯－3，17－二酮是制造甾體激素類藥物的關鍵中間體，在其甾體母核上引入羥基，可使其抗炎活性大大增強。經(jīng)轉化獲得的11α－羥基雄甾－4－烯－3，17－二酮是制備用于治療高血壓及充血性心力衰竭的新型藥物的關鍵中間體，臨床療效優(yōu)于同類藥物[3－4]。

目前，關于微生物法轉化甾體藥物的新菌種及新技術研究發(fā)展態(tài)勢良好。國內(nèi)外研究工作主要集中在甾醇制備雄甾－4－烯－3，17－二酮，以及運用赭曲霉及綠僵菌等菌種催化黃體酮，關于黑根霉催化合成11α－羥基雄甾－4－烯－3，17－二酮的內(nèi)容鮮有報道[5－6]。

本文采用微生物轉化法，以黑根霉RN－M246為實驗菌種，雄甾－4－烯－3，17－二酮為底物，合成11α－羥基雄甾－4－烯－3，17－二酮，考察并優(yōu)化11α－羥基化反應條件，提高產(chǎn)品轉化率，為11α－羥基雄甾－4－烯－3，17－二酮的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

黑根霉RN－M246，清華大學生命科學院提供；雄甾－4－烯－3，17－二酮，11α－羥基 雄甾－4－烯－3，17－二酮，購自Sigma公司；其余各試劑均為分析純，市售。

斜面培養(yǎng)基：小米培養(yǎng)基，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：葡萄糖30，蛋白胨20，冷榨豆粉10，檸檬酸三銨1，磷酸氫二鉀5，pH 5.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備

黑根霉斜面中加適量無菌水，將孢子洗下，紗布過濾，充分振蕩，制成107～108個／mL孢子懸液。

1.2.2 搖瓶轉化工藝

在500mL搖瓶中加入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接入4%的菌懸液，28℃、160r／min培養(yǎng)24h，其后加入10mmol／L的底物并提高轉速至220r／min繼續(xù)轉化48h。

1.2.3 菌體干重的測定

抽濾發(fā)酵液，分離菌絲體及轉化液，并將菌體用去離子水洗滌3次，放入80℃烘箱內(nèi)烘干至恒重。

1.2.4 分析方法

將發(fā)酵液高速離心，取上清液用甲醇稀釋，將稀釋液用0.45μm有機濾膜過濾，作為檢測樣品，運用HPLC測定分析。色譜條件：C18烷基硅烷鍵合反相柱；流動相甲醇－水的體積比為3∶2；體積流量0.8mL／min；色譜柱溫25℃；紫外檢測器波長242nm。

2 結果與討論

2.1 底物投料時間對產(chǎn)品轉化率的影響

為確定底物投料的最佳時間，分別在反應開始以及菌體生長6、12、18、24、30、36h后投放10mmol／L的雄甾－4－烯－3，17－二酮，投放48h后考察其轉化情況。

如圖1所示，菌體發(fā)酵的前24h投料比其后投料效果好，并且在反應開始時投料轉化率最高。分析其原因認為，雖然甾體對微生物具有毒性，但在底物添加量較少時，毒性抑制作用也很小。在菌體未成熟前，菌體不纏繞，較分散，此時添加少量底物，底物與菌體接觸面積較大，更易充分接觸，從而誘導更多利于底物進行11α－羥基化的酶生成，因此轉化率高于菌體成熟后再添加底物。由此判斷，反應開始時為添加底物的最佳時間。

圖1 底物投料時間對轉化率的影響Fig.1 Effect of feeding time on the conversion rate

2.2 發(fā)酵時間對產(chǎn)品轉化率的影響

將底物與培養(yǎng)基一起滅菌后接種發(fā)酵，分別間隔12h檢測轉化率。通過不同的取樣時間考察發(fā)酵過程，確定最佳的發(fā)酵時間。

如圖2所示，發(fā)酵時間在12～48h，底物迅速轉化，其后轉化率增長緩慢，72h后轉化率幾乎不再提高，且可觀察到菌體形態(tài)在72h后逐漸變得細碎。推測原因為發(fā)酵時間較長，培養(yǎng)基中菌體生長所需的營養(yǎng)物質變少，導致菌體不再生長甚至開始自溶，酶活力降低。因而發(fā)酵最佳時間為72h。

圖2 發(fā)酵時間對轉化率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the conversion rate

2.3 接種量對產(chǎn)品轉化率的影響

接種量是決定菌體量、菌體形態(tài)及轉化體系的重要因素之一。因而分別考察接入體積分數(shù)為2%、3%、4%、5%、6%、8%的菌懸液對轉化率的影響。

由圖3可知，接種量越大，菌絲體生長得越多，但接種量較多不利于轉化。當接種量為4%時，轉化率較高，因而選用4%為最佳接種量。

2.4 裝液量對產(chǎn)品轉化率的影響

黑根霉為好氧菌，且羥基化作用中的氧來自于空氣[7]，適當?shù)娜苎趿坎粌H有利于菌體的生長，同時也促進羥基化反應的順利進行，因而溶氧量是重要的考察因素。裝液量在一定程度上與溶氧量相關，可通過裝液量考察溶氧對發(fā)酵或生物轉化的影響。本實驗選用500mL搖瓶，分別考察裝液量為25、50、75、100、125mL時對轉化率的影響。

圖3 接種量對轉化率及菌體干重的影響Fig.3 Effect of inoculum concentration on the conversion rate and mycelium dry weight

溶氧量與菌體的生長發(fā)育、代謝途徑以及產(chǎn)物形成密切相關。如圖4所示，當裝液量較低時轉化率低，當裝液量提高到75mL時，溶氧量較適宜，轉化率最高可達47.5%，因而選用75mL為最佳裝液量。

圖4 裝液量對轉化率的影響Fig.4 Effect of volume of culture medium on the conversion rate

2.5 轉化溫度對產(chǎn)品轉化率的影響

在生物轉化過程中需要充足的菌體和酶，因而，菌體在28℃條件下生長24h后，在保證菌體量及酶的高活性的前提下，改變轉化溫度，考察轉化過程最適宜的溫度。由圖5可見，在菌體生長較為成熟且轉化仍迅速進行的24h時改變溫度，發(fā)現(xiàn)溫度小于28℃時轉化率較低，轉化率隨著溫度升高而升高，28℃時轉化率達到最高，大于28℃后轉化率略有下降。推測可能溫度過高和過低對菌體生長或產(chǎn)相關酶不利，也可能使11α－羥基化酶活性降低。對于黑根霉催化雄甾－4－烯－3，17－二酮的11α－羥基化反應而言，28℃較適宜。

圖5 轉化溫度對轉化率的影響Fig.5 Effect of conversion temperature on the conversion rate

3 結 論

采用微生物轉化法，以黑根霉RN－M246為實驗菌種，雄甾－4－烯－3，17－二酮為底物，進行11α－羥基化反應合成11α－羥基雄甾－4－烯－3，17－二酮。通過工藝優(yōu)化確定較優(yōu)的工藝為每500mL搖瓶裝入75mL發(fā)酵培養(yǎng)基，同時添加10mmol／L的底物，滅菌后超聲，接入4%的菌懸液，在28℃發(fā)酵72h，轉化率比優(yōu)化前提高了約12%，最終轉化率可達47.8%。

[1]郭一平，鄭璞.甾體微生物C11α－羥化反應的研究進展[J].浙江工業(yè)大學學報，2004，32(4)：437－441.

[2]郭明，胡昌華.生物轉化－從全細胞催化到代謝工程[J].中國生物工程雜質，2010，30(4)：110－115.

[3]楊英，姜紹通.微生物降解甾醇側鏈轉化雄甾－4－烯－3，17－二酮的研究進展[J].微生物學通報，2006，33(6)：142－145.

[4]DAVIS K L，NAPPI J M.The cardiovascular effects of eplerenone，a selective aldosterone－receptor antagonist[J].Clinical Therapeutics，2003，25(11)：2647－2668.

[5]葉麗，史濟平.甾體微生物在制藥工業(yè)中的應用[J].工業(yè)微生物，2001，31(4)：40－48.

[6]王普，陳希楊，虞炳鈞，等.新技術在甾體藥物微生物轉化中的應用[J].化工進展，2002，21(11)：805－813.

[7]PETERSON J A，GRAHAM S E.A close family resemblance：the importance of structure in understanding cytochromes P450[J].Structure，1998，6(9)：1079－1085.