金 楊，王 燕

（1．大理州中醫(yī)醫(yī)院，云南大理 671000；2．大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

巖陀為虎耳草科植物西南鬼燈擎Rodgersia sambucifolia Hemsl.或羽葉鬼燈擎Rodgersia pinnata Hemsl.的干燥根莖，主產(chǎn)于云南、貴州、山西、四川等地〔1〕。具有消炎、收斂、祛風除濕的功效，對腸炎、菌痢、感冒頭痛、風濕骨痛、外傷出血、老年性支氣管炎等常見疾病有較好的療效，故在民間廣泛應用。對其有效成分之一的巖白菜素研究已有大量文獻報道〔2-6〕，但對巖陀中槲皮素方面的相關研究報道卻很罕見。槲皮素具有降低血脂、降低血管脆性、抗炎、抗菌、抗過敏、抗自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗癌、延緩衰老、抗病毒；瀉下、增強免疫、解痙等作用〔7-9〕。因此，本文收集不同產(chǎn)地不同采收期的巖陀藥材，對其中具有廣泛生理活性的槲皮素采用HPLC法進行含量測定〔10〕，為巖陀資源的合理應用、保護，更好地控制巖陀藥材的質(zhì)量以及進一步對該藥材進行開發(fā)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AD型HPLC系統(tǒng)（日本島津公司，包括CTO-20AC柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器、SPD-M20A二極管陣列檢測器、LC solution工作站）；Sartorius BS 110S電子天平（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥 槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100081-200406）；甲醇為色譜純（美國Tidea公司）；水為雙蒸水；其他試劑均為分析純；實驗所用巖陀藥材均由大理學院藥學與化學學院生藥教研室周濃副教授鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱：DiamonsilC18（4.6 mm×200mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.5%磷酸溶液（50∶50）；檢測波長：370 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按槲皮素峰計不低于4000。對照品及樣品色譜。見圖1。

2.4 供試品溶液制備方法的考察

2.4.1 檢測波長的選擇 用SPD（二級管陣列檢測器）對槲皮素對照品溶液和供試品溶液進行190～800 nm范圍的光譜掃描，見圖2-3。從圖中可知，槲皮素對照品溶液和供試品溶液在370 nm都有一個比較明顯且無干擾的單峰，從槲皮素峰純度值大于0.999可知，本實驗所采用的檢測條件合理可行，在370 nm處無其他雜質(zhì)峰的干擾。因此，將370 nm作為槲皮素含量測定的波長。

圖1 對照品及樣品色譜圖

圖2 槲皮素對照品溶液的光譜和峰純度掃描結果

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定干燥至恒重的槲皮素對照品11.56 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取該溶液5 mL至50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取該溶液2 mL至10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.004624 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取各編號的巖陀粉末（過4號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25%HCl（4∶1）混合溶液50 mL，密塞，稱定重量，置水浴中回流1 h，冷卻，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4.2 供試品溶液提取時間的考察 取巖陀2號樣品1 g各5份，精密稱定，分別回流不同的時間制備供試品溶液，進樣測定。結果發(fā)現(xiàn)回流1 h后，槲皮素含量無明顯增加，因此供試品溶液提取時間選為回流1 h。見表1。

表1 不同提取時間考察結果

2.5 線性關系考察 分別精密吸取槲皮素對照品溶液（C=0.004624 mg/mL）1、2、3、4、5、6 μL進樣，以槲皮素進樣量（X）為橫坐標，色譜峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得：Y=7497441.97X－6927.93（r=0.9999），結果表明槲皮素在0.004624～0.02774 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 分別精密吸取槲皮素對照品溶液（C=0.004624 mg/mL）10 μL，連續(xù)進樣6次測定，色譜峰面積的RSD為0.12%。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取巖陀2號樣品1 g，精密稱定，分別于2、3、4、5、6、24 h進樣測定，色譜峰面積的RSD為0.59%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 重復性試驗 精密稱定巖陀2號樣品6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL進行測定，計算槲皮素含量，其RSD為1.43%，表明方法重復性良好。見表2。

表2 重復性試驗結果

2.9 加樣回收率試驗 精密稱定已知槲皮素含量（0.1788 mg/g）的巖陀2號樣品各6份，等量加入槲皮素對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，計算回收率。槲皮素的平均回收率為96.77%。RSD為1.83%。槲皮素回收率試驗結果見表3。

表3 槲皮素回收率試驗測定結果

2.10 耐用性試驗 分別采用3支不同品牌的C18色譜柱對同一巖陀2號樣品進行測定，槲皮素含量平均值為0.1777 mg/g，RSD為2.38%。表明該方法的耐用性良好。見表4。

表4 耐用性試驗結果

2.11 含量測定 取各編號巖陀藥材，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，進樣測定，以外標法計算供試品中槲皮素含量，各編號藥材平行操作3份。見表5。

表5 不同產(chǎn)地不同采收期巖陀藥材中槲皮素的含量（n=3）

3 討論

從實驗數(shù)據(jù)上看，不同產(chǎn)地相同采收期以及相同產(chǎn)地不同采收期的巖陀藥材中槲皮素的含量相差較大，提示我們在用藥時應注意產(chǎn)地、采收期與藥材質(zhì)量的關系。相同采收期中以云南鶴慶產(chǎn)地的巖陀含槲皮素最高，貴州水城的較低；同一產(chǎn)區(qū)不同采收月份槲皮素的含量大小順序為：9月＞8月＞7月＞10月＞6月＞3月。根據(jù)測定結果，可初步確定巖陀的最佳采收時期為秋季，即7月開始采收，10月結束，其中9月槲皮素的含量最高。

本實驗以甲醇-0.5%磷酸溶液（50∶50）為流動相，槲皮素峰可以達到基線分離，峰形對稱，分離度好，采用370 nm作為檢測波長，可以和藥材中其它雜質(zhì)峰分離完全，得到的峰純度值較高。本法簡便、準確、重復性好，方法學考察均符合要求。

本課題組一直致力于巖陀藥材的開發(fā)研究，對該藥材的指紋圖譜、質(zhì)量標準、巖白菜素提取工藝優(yōu)化及其含量測定等都有相應研究。本實驗建立巖陀藥材中槲皮素的含量測定方法為該藥材多指標成分的檢測控制提供科學依據(jù)，對該藥材的實際開發(fā)研究提供實驗依據(jù)。巖陀藥材中巖白菜素和槲皮素的含量變化趨勢在不同產(chǎn)地不同采收期的情況下是否趨于一致，有待下一階段的研究。

〔1〕王燕，金楊，劉振琪.巖陀中巖白菜素提取工藝優(yōu)化的探索〔J〕.大理學院學報，2012，11（9）：8-11.

〔2〕金楊，王燕.正交試驗優(yōu)選復方巖白菜素滴丸制備工藝〔J〕.中國藥房，2011，22（7）：614-615.

〔3〕王燕，鮑家科，金楊，等.巖陀藥材質(zhì)量標準研究〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2011，17（10）：85-88.

〔4〕張麗艷，李燕，楊玉琴，等.貴州虎耳草的質(zhì)量對比研究〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2010，16（18）：57-59.

〔5〕夏從龍，段新瑜，何華斌，等.民族藥巖陀藥材中巖白菜素的高效液相色譜定量分析〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（2）：289-290.

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