蔣婷 楊澤龍 白倩 周廣東 劉偉

成體干細(xì)胞可來源于骨髓、脂肪、皮膚、肌肉、角膜等各類組織[1-5]，脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ASCs）因其在體內(nèi)分布廣、取材創(chuàng)傷小、細(xì)胞獲得量大等優(yōu)點(diǎn)，成為間充質(zhì)干細(xì)胞新的研究熱點(diǎn)。大量的研究已經(jīng)證實(shí)，ASCs有向多個譜系分化的潛能（骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、肌、內(nèi)皮等）[6-12]，目前已被廣泛應(yīng)用于多種組織工程化組織構(gòu)建的研究中。組織工程化組織構(gòu)建需要大量優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞，一般而言，較早代次的種子細(xì)胞活力好、干細(xì)胞特性強(qiáng)，但細(xì)胞數(shù)量有限，很難達(dá)到組織構(gòu)建對細(xì)胞量的需求，需要在體外多次傳代擴(kuò)增，細(xì)胞代次擴(kuò)增一次，數(shù)量可增加3倍左右。但也不能無限制地擴(kuò)增，成體干細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增過程中易于老化，多次傳代后細(xì)胞增殖減慢，分化潛能降低[13-15]。因此，需要觀察不同代次細(xì)胞的增殖能力及分化能力。眾所周知，間充質(zhì)干細(xì)胞具有向脂肪誘導(dǎo)分化的潛能，脂肪干細(xì)胞因其來源的特殊性，其成脂分化能力與其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞有所不同。在我們研究ASCs成脂分化能力時，并未考慮脂肪前體細(xì)胞的作用。因此，有必要對ASCs自發(fā)成脂能力及誘導(dǎo)成脂分化潛能進(jìn)行探討。本實(shí)驗(yàn)通過對不同代次mASCs增殖能力、體外自發(fā)成脂能力及誘導(dǎo)成脂分化潛能的觀察分析，為優(yōu)化組織工程種子細(xì)胞提供更多參數(shù)，為組織工程化組織構(gòu)建種子細(xì)胞的合理選用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑及儀器

6～8周齡C57BL/6小鼠（野生型小鼠，wild type）購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。膠原酶NB4（包含Ⅰ型膠原酶，Ⅱ型膠原酶和中性蛋白酶）購于Serva公司，DMEM購于HyClone公司，胎牛血清購于SAFC Bioscience公司，Mx3000P熒光定量PCR儀購于美國Stratagene公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑購于Promega公司，定量PCR試劑POWER SYBY Green PCR Master Mix購于美國Applied Biosystems公司，定量PCR引物由上海生工生物公司合成，其余試劑均購于Sigma公司。

1.2 mASCs體外分離與培養(yǎng)

取6～8周齡雌性C57BL/6小鼠，斷頸處死，75%乙醇浸泡15 min，超凈工作臺內(nèi)無菌條件下暴露腹股溝脂肪，切取并剪碎，放于50 mL離心管中。氯霉素浸泡沖洗15 min后，PBS沖洗3遍，加5倍體積的0.1%膠原酶NB4于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化1.5 h，150目無菌尼龍網(wǎng)篩過濾，1 500 r/min離心5 min。棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗滌2次，以含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液培養(yǎng)。將分離收獲在離心管中的細(xì)胞懸液以1×105cells/cm2密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后換液，去除未貼壁及懸浮死細(xì)胞并加入新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長達(dá)到90%匯合時即可消化傳代。用0.25%胰蛋白酶消化傳代，以0.5×104～1×104cells/cm2細(xì)胞密度接種于新的培養(yǎng)皿內(nèi)。再次達(dá)到90%融合時，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.3 生長曲線

分別取原代（P0）、第 2 代（P2）及第 5 代（P5）細(xì)胞，消化，制備成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×104cells/mL，接種 24孔板，每孔接種 1 mL，分 8組，每組3孔。接種第1天用0.25%胰蛋白酶消化第1組，制成細(xì)胞懸液1 mL，加入電解液19 mL，對總體積20 mL的細(xì)胞懸液，進(jìn)行計數(shù)，取平均值，作為細(xì)胞計數(shù)的基數(shù)（起始數(shù)）。第2天開始計數(shù)，每天計數(shù)1組，取3個孔的均值，至第8天結(jié)束。繪制生長曲線，并計算群體倍增時間。

1.4 體外自發(fā)成脂能力檢測

分別收集原代（P0）、第二代（P2）及第五代（P5）細(xì)胞，將細(xì)胞制成5×107cells/mL的細(xì)胞懸液，每滴10 μL，接種于六孔板內(nèi)，每孔接種5滴，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中放置15 min，加入含10%血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。3 d更換培養(yǎng)液，不傳代，培養(yǎng)1個月后進(jìn)行油紅染色、RT-PCR檢測PPARγ及LPL表達(dá)水平。

油紅染色：細(xì)胞經(jīng)4%甲醛4℃固定1 h，蒸餾水沖洗，加入60%異丙醇，室溫放置1 min，吸盡后加入2%油紅試劑，室溫放置5～10 min，60%異丙醇洗去多余染液，蒸餾水沖洗后觀察。

1.5 成脂分化潛能檢測

分別收集原代（P0）、第 2 代（P2）及第 5 代（P5）細(xì)胞，按1×105個/孔的密度分別接種于6孔板中，進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，誘導(dǎo)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液（高糖DMEM加 入 10%FBS） 加 入 0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L DEX、10 μmol/L insulin、200 μmol/L indomethacin，誘導(dǎo)2周后，進(jìn)行油紅染色、RT-PCR檢測PPARγ及LPL表達(dá)水平。

1.6 RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄及定量PCR

常規(guī)抽提細(xì)胞RNA，反應(yīng)液：MgCl2（25 mM）4 μL；10×反應(yīng)緩沖液 2 μL；無 RNA 酶 H2O 8.5 μL；dNTP混合物 10 mM 2 μL；RNA 酶抑制劑 40 U/μL 0.5 μL；逆轉(zhuǎn)錄酶5 U/μL 1 μL；隨機(jī)引物或寡聚核苷酸引物2.5 pmol/μL或特異的下游引物1 μL；實(shí)驗(yàn)樣品RNA 1 μL（≤1 μg total RNA）。按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：30 ℃，10 min；42 ℃，60 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min。

定量PCR試劑POWER SYBY Green PCR Master Mix，應(yīng)用Mx3000P熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件為：95 ℃，30 sec；57 ℃，30 sec；72 ℃，45 sec，40個循環(huán)。Mx3000P分析軟件進(jìn)行分析。引物設(shè)計序列如下。

LPL：產(chǎn)物片段長度219 bp；退火溫度60℃。上游引物5'-AAGCCCTGCTCCTGGTGGTC-3'，下游引物5'-CGAAGGTCTTGCTGCTGTGG-3'。

PPARγ：產(chǎn)物片段長度268 bp；退火溫度58℃。上游引物5'-AGACCACTCGCATTCCTTT-3'，下游引物5'-CCCACAGACTCGGCACTCA-3'。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

各項(xiàng)定量指標(biāo)均以x±s表示，應(yīng)用SPSS 11.5軟件包對各定量指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同代次細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

原代分離的小鼠脂肪干細(xì)胞呈體積較小的圓球形，1～2 h開始貼壁生長，6 h左右細(xì)胞伸展開來，呈短梭形，隨著傳代，細(xì)胞體積增大，傳代后迅速貼壁，貼壁后的細(xì)胞逐漸伸展，外觀主要呈長梭型及不規(guī)則型，到第5代仍有很強(qiáng)的增殖能力（圖1）。

2.2 生長曲線

生長曲線顯示，培養(yǎng)的P0、P2、P5細(xì)胞均具有較強(qiáng)的分裂增殖能力，均出現(xiàn)24 h停滯生長期，第3～4天進(jìn)入快速增殖期，體外擴(kuò)增速度相似，均在第6天進(jìn)入生長停止?fàn)顟B(tài)。P0、P2、P5細(xì)胞傳代接種后的潛伏期、對數(shù)生長期、平臺期無明顯差異（圖2），群體倍增時間大約為48 h。

2.3 自發(fā)成脂能力檢測

小鼠脂肪干細(xì)胞局部高密度接種后培養(yǎng)，高密度區(qū)域形成密集的圓形、三角形或多角形細(xì)胞團(tuán)，周邊未接種區(qū)域細(xì)胞亦很快爬滿培養(yǎng)皿，細(xì)胞體積較大，呈長梭形或不規(guī)則形。培養(yǎng)1個月時，油紅染色發(fā)現(xiàn)，P0細(xì)胞高密度接種區(qū)域有大量的陽性染色（圖3A）；P2細(xì)胞高密度接種中心區(qū)域亦有陽性染色，但明顯弱于P0細(xì)胞（圖3B）；P5細(xì)胞高密度接種區(qū)域有極少微弱的陽性染色（圖3C）。細(xì)胞低密度或爬行生長區(qū)域均無陽性染色。

PT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，自發(fā)分化1個月后，P0細(xì)胞PPARγ表達(dá)強(qiáng)于P2細(xì)胞，P2細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)于P5細(xì)胞；LPL表達(dá)亦有同樣的趨勢，P<0.05（圖3）。說明隨著培養(yǎng)代次的增加，脂肪干細(xì)胞中脂肪前體細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，到第5代時脂肪前體細(xì)胞的數(shù)量已降至很低。

2.4 誘導(dǎo)成脂分化潛能檢測

成脂誘導(dǎo)7 d左右，P0、P2、P5細(xì)胞鏡下觀察均有脂滴出現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)時間的延長，脂滴逐漸增多，變大，2周時停止誘導(dǎo)，油紅染色顯示脂滴呈橘紅色，3組細(xì)胞無明顯差異。PT-PCR檢測，P0細(xì)胞PPARγ及LPL表達(dá)略強(qiáng)于P2及P5細(xì)胞，但3組PPARγ及 LPL表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05（圖 4）。說明隨著培養(yǎng)代次的增加，脂肪干細(xì)胞中間充質(zhì)干細(xì)胞的含量并未減少，到第5代時仍維持了較好的干細(xì)胞特性。

圖1 不同代次 mASCs的細(xì)胞形態(tài)。 A：P0；B：P2；C：P5。 （標(biāo)尺：100μm）Fig.1 Morphological observation of different passages of mASCs.A:P0;B:P2;C:P5.(Scale:100 μm)

圖2 不同代次mASCs的生長曲線Fig.2 Growth curve of different passages of mASCs

圖3 不同代次mASCs自發(fā)成脂RT-PCR 檢測（A：P0；B：P2；C：P5。 標(biāo)尺：100 μm）Fig.3 The spontaneous adipogenic ability of different passages of mASCs observed by RT-PCR（A：P0；B：P2；C：P5.Scale:100 μm）

圖4 不同代次mASCs誘導(dǎo)成脂RTPCR 檢測（A：P0；B：P2；C：P5。 標(biāo)尺：100 μm）Fig.4 The adipogenic potential of different passages of mASCs observed by RT-PCR（A：P0；B：P2；C：P5.Scale:100 μm）

3 討論

通常所說的脂肪干細(xì)胞，確切地應(yīng)該叫脂肪來源細(xì)胞，基本參考文獻(xiàn)[2]的方法從脂肪組織中分離培養(yǎng)而獲得，是一個混雜的細(xì)胞群，除含有間充質(zhì)干細(xì)胞外，還含有諸如脂肪前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血管周皮細(xì)胞等混雜細(xì)胞[16]。脂肪前體細(xì)胞是向脂肪細(xì)胞分化的特異化的前體細(xì)胞，是成熟脂肪細(xì)胞的前體，通常不經(jīng)誘導(dǎo)亦能向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)觀察了各代小鼠脂肪干細(xì)胞的增殖能力、自發(fā)成脂能力及誘導(dǎo)成脂潛能，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)代次的增加，其增殖能力沒有明顯變化，自發(fā)成脂能力明顯降低，而誘導(dǎo)成脂能力基本不變。自發(fā)成脂能力與脂肪前體細(xì)胞含量有關(guān)，而誘導(dǎo)成脂潛能與間充質(zhì)干細(xì)胞含量有關(guān)，說明原代細(xì)胞中含有更多的脂肪前體細(xì)胞，隨著培養(yǎng)代次的增加，含量不斷減少，而間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)多次傳代仍能很好地維持干細(xì)胞特性。常規(guī)的培養(yǎng)體系不利于成熟脂肪細(xì)胞及脂肪前體細(xì)胞生長，多次傳代培養(yǎng)可能使間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)勢生長，降低了脂肪前體細(xì)胞及其他混雜細(xì)胞的含量，使脂肪干細(xì)胞得到一定程度的純化。

應(yīng)用小鼠脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞時，需要根據(jù)構(gòu)建組織的不同而選擇不同代次的細(xì)胞。我們在應(yīng)用小鼠脂肪干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化肌腱的研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用較早代次細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化肌腱中有脂肪組織形成，而應(yīng)用較晚代次（5～7代）細(xì)胞則不會有脂肪組織形成，能構(gòu)建出較均質(zhì)的肌腱樣組織。脂肪干細(xì)胞成骨及成軟骨能力均低于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞[17-18]，尤其是成軟骨能力，Afizah等[19]認(rèn)為，脂肪干細(xì)胞僅有很弱的成軟骨能力，不適合作為軟骨構(gòu)建的種子細(xì)胞。利用脂肪干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨需要進(jìn)行分選純化，人脂肪干細(xì)胞可利用CD105分選富集軟骨潛能干細(xì)胞[20]，目前尚未見應(yīng)用小鼠脂肪細(xì)胞在體外構(gòu)建出均質(zhì)組織工程化軟骨的報道，需要進(jìn)一步研究純化小鼠脂肪干細(xì)胞及優(yōu)化誘導(dǎo)方案。構(gòu)建脂肪組織時，在保證細(xì)胞量足夠的前提下應(yīng)選擇盡可能早的代次。脂肪干細(xì)胞雖具有向骨、軟骨、神經(jīng)、肌等多個譜系分化的潛能，但其來源于脂肪組織，具有自發(fā)成脂分化潛能，是脂肪組織工程理想的種子細(xì)胞，有望解決目前臨床應(yīng)用自體脂肪充填時出現(xiàn)的高吸收率、易液化壞死等問題。

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