趙美威，段承俐，劉 江

1. 云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術學院，云南 昆明 650201

2. 中國科學院昆明動物研究所 中國科學院和云南省動物模型與人類疾病機理重點實驗室，云南 昆明 650223

—鋅指蛋白（zinc finger proteins, ZFPs）DNA結合域及限制性內(nèi)切酶 FokI核酸酶結構域所組成的能夠?qū)蚪M進行定點編輯的融合蛋白（Bibikova et al, 2001; Kim et al, 1996）。ZFP DNA結合域能夠使ZFN結合特定DNA序列，并于基因組的特定位點產(chǎn)生雙鏈斷裂（double-strand break, DSB），隨后，通過細胞本身對雙鏈斷裂的修復來實現(xiàn)對基因組的定點編輯。經(jīng)過～15年的發(fā)展，ZFN技術已經(jīng)被成功應用于體外培養(yǎng)的人類細胞及多種模式生物，甚至一期臨床試驗研究（Urnov et al, 2010）。然而，其固有的局限性也在很大程度上阻礙了 ZFN技術的更廣泛發(fā)展（DeFrancesco, 2011），例如，（1）由于ZFP的氨基酸序列和它所識別的DNA序列之間并非一一對應，且在自然界中無法找到能夠識別三個連續(xù)核苷酸的鋅指結構域，故ZFNs靶位點的選擇受到了很大限制；（2）由于 ZFN技術專利被Sangamo BioSciences 公司所壟斷，且ZFNs的設計與合成技術難度很大，因此，對于大多數(shù)實驗室而言，該技術成本過高，不適于廣泛應用；（3）可能由于在基因組的很多位點存在脫靶現(xiàn)象，故ZFN技術的細胞毒性很強（Carroll, 2008; Mani et al, 2005）。

近年來，基于類轉錄激活因子效應物（transcription activator-like effectors，TALEs）的基因組操控技術的發(fā)展和應用有望彌補 ZFN技術的局限性。TALEs是來源于植物病原體——黃單胞桿菌（Xanthomonas spp.）的DNA結合蛋白，被注入植物宿主后，可與宿主特定基因的啟動子結合，從而調(diào)控該基因的轉錄，并最終影響植物發(fā)病過程。2007年，首次報道了TALEs具有結合DNA 的特性（Romer et al, 2007）。兩年以后，兩個獨立研究組分別破譯了 TALEs識別 DNA序列的編碼法則（Boch et al, 2009; Moscou & Bogdanove, 2009）。TALEs理論上可以識別任何DNA序列，盡管該技術開發(fā)的時間相對較晚，但是，已經(jīng)在酵母、植物、斑馬魚、大鼠和多種體外培養(yǎng)的人類細胞中得到了成功應用（Sanjana et al, 2012）。研究者已經(jīng)運用該技術成功上調(diào)了目的基因轉錄（Geissler et al, 2011;Miller et al, 2011; Morbitzer et al, 2010; Sanjana et al,2012; Zhang et al, 2011）以及對基因組編輯（Bogdanove & Voytas, 2011; DeFrancesco, 2011;Scholze & Boch, 2011; Tesson et al, 2011）。目前看來，TALEs技術可以和 ZFNs技術一樣用于多物種的基因組定點操控，并且在某些方面具有一定優(yōu)勢。

本文綜述了近年來TALEs技術的發(fā)展和應用，分類討論了運用 TALEs對內(nèi)源基因進行轉錄調(diào)控和基因組編輯（包括基因敲除和基因插入）的策略，并對該技術在基因組操控應用中的特異性及其相對于ZFNs技術的優(yōu)勢進行了探討。

1 類轉錄激活因子效應物（TALEs）

TALEs是由多種黃單胞桿菌所分泌的天然細菌效應物蛋白，主要通過調(diào)控宿主植物的基因轉錄，從而促進黃單胞桿菌在植物體內(nèi)的繁殖和擴散。天然 TALEs 主要由位于 N端的轉運信號（translocation signal）、位于 C端的核定位信號（nuclear localization signals, NLS）和轉錄激活結構域（transcriptional activation domain, AD）以及位于中間的DNA結合結構域三部分組成（iii）（Boch &Bonas, 2010; Bogdanove et al, 2010）。DNA結合結構域由包含33～35（通常為34）個氨基酸殘基的重復單元串聯(lián)而成，介導DNA特異識別與結合（圖1A）。天然TALEs所包含的重復單元數(shù)為1.5～33.5（Boch & Bonas, 2010）。每個重復單元序列高度保守，主要區(qū)別在于第12和第13位的重復可變雙殘基（repeat variant di-residue, RVD）。研究發(fā)現(xiàn)每個重復單元的 RVD決定了其所識別的核苷酸，且其識別遵循一個簡單法則：NI=A, HD=C, NG=T,NN=G or A（圖 1a）（Boch et al, 2009; Moscou &Bogdanove, 2009）。另外，最近的研究表明NH作為一種RVD 也能夠高效識別G，且特異性高于NN（Streubel et al, 2012）。對TALE蛋白晶體結構的分析發(fā)現(xiàn)，每個TALE重復單元由一個短α螺旋和一個長α螺旋通過一個包含RVD的環(huán)相連形成，第12位的氨基酸殘基主要起穩(wěn)定RVD環(huán)的作用，而第13位的氨基酸殘基決定TALE蛋白所識別的核苷酸，所有的重復單元相互連接在一起形成可以鑲嵌在TALE蛋白所識別的DNA的大溝中的右手超螺旋結構（Deng et al, 2012a; Mak et al, 2012）。TALE蛋白識別核苷酸的簡單法則和其晶體結構解釋了TALEs識別DNA的特異性，且由于每個重復單元與其所識別核苷酸一一對應，因此，理論上可以人為設計能夠識別并結合任何DNA序列的TALEs蛋白。研究還發(fā)現(xiàn)RVD為NG的重復單元可以特異識別并結合5-甲基胞嘧啶（mC），即TALEs蛋白還可以識別甲基化的核苷酸（Deng et al, 2012b）。目前尚不明確為什么自然界中發(fā)現(xiàn)的 TALEs在植物基因組中所識別的5′端第一個堿基總是T（Boch et al, 2009; Moscou & Bogdanove, 2009），以及為什么串聯(lián)重復的DNA結合域總是以半個重復單元結束，但是，它們對于TALEs的活性均至關重要（圖1a）。因此，TALEs所識別的DNA序列的長度=完整重復單元數(shù)+2。如圖1B中的TALE共包含17個完整重復單元，但其所識別的堿基序列應為“TGGAAGACCGCCAGGGGGT”，共 19個堿基?？傊?，TALE蛋白識別核苷酸簡單法則的破譯以及其晶體結構的解析已經(jīng)為 TALEs在基因組定點操控中的應用奠定了理論基礎。

圖1 TALE蛋白結構及其基因組操控模型Figure 1 Structure and genome engineering model of TALE proteins

TALEs技術要想成功應用，靶位點選擇至關重要。從目前的研究結果來看，人工設計的 TALEs所識別的5′端第一個堿基必須為T （Bogdanove &Voytas, 2011；Reyon et al, 2012）。此外，為了便于利用TALEs開展研究工作，許多實驗室還建立了公開網(wǎng)站幫助研究人員預測和設計 TALEs 靶位點。例如：Bogdanove 和 Voytas 實驗室建立的TALE-NT 網(wǎng)站（https://tale-nt.cac.cornell.edu/）、Joung 實驗室建立的 ZiFiT 網(wǎng)站（http://zifit.partners.org/ZiFiT/）和 Zhu實驗室建立的 idTALE網(wǎng)站（http://idtale.kaust.edu.sa/）等。

TALEs靶位點設計完成后，如何合成能夠識別靶位點的TALEs蛋白就成為TALE技術中關鍵步驟和應用瓶頸。雖然，目前已有多種方法可解決該問題，多個生物技術公司（包括國內(nèi)的公司）也已可提供TALEs合成服務，但是，對于大多數(shù)實驗室來說，要想自己合成具有高活性的 TALEs仍較有難度，因此，本文不深入探討人工構建TALEs。

2 基于TALEs的靶向轉錄調(diào)控

TALE蛋白模塊化的結構非常有利于人為設計轉錄因子來調(diào)控特定基因的轉錄。天然TALEs的主要功能是激活宿主易感基因的轉錄，從而促進病原體在宿主體內(nèi)的繁殖和擴散（Boch & Bonas, 2010;Bogdanove et al, 2010）。植物病原體黃單胞桿菌通過III型類注射器分泌系統(tǒng)將TALEs注入宿主細胞，然后TALEs被轉運到細胞核，并通過DNA結合域與目標基因轉錄起始位點上游序列結合來激活目標基因轉錄。因此，可通過人為融合TALEs與轉錄激活結構域（AD）或者轉錄抑制結構域（RD）來調(diào)控內(nèi)源基因轉錄（Bogdanove & Voytas, 2011）。

通過融合人為設計的 TALEs與內(nèi)源轉錄激活結構域、來源于單純皰疹病毒的VP16轉錄激活結構域（圖1b）或者VP16四聚體衍生物VP64，已有多個研究組成功實現(xiàn)了基因轉錄的靶向激活（Geissler et al, 2011; Miller et al, 2011; Morbitzer et al, 2010; Sanjana et al, 2012; Zhang et al, 2011）。通過與轉錄起始位點上游序列特異性結合，TALE-ADs可通過特異性招募轉錄復合體來起始基因轉錄。這些人工合成的TALE-ADs可在植物中（Geissler et al,2011; Morbitzer et al, 2010）及體外培養(yǎng)的人類細胞中起作用（Geissler et al, 2011; Miller et al, 2011;Sanjana et al, 2012; Zhang et al, 2011），通?？梢允鼓康幕虮磉_增加 20倍以上。在相同條件下，人為設計并合成的特異性TALE-ADs與ZF-VP64具有相似甚至更好的作用效果（Zhang et al, 2011）。另外，在植物中，使用內(nèi)源轉錄激活結構域效果優(yōu)于VP16，但是，在體外培養(yǎng)的人類細胞中，情況卻正好相反（Geissler et al, 2011）。同樣，通過融合人為設計的TALE與轉錄抑制結構域即可特異性抑制基因轉錄（Bogdanove & Voytas, 2011）。

雖然，大多數(shù)人工合成的TALE-ADs具有很強的激活轉錄能力，但效果卻相去甚遠，即可能存在其它影響TALEs與DNA結合的因素（Zhang et al,2011），例如，每種RVD與DNA結合強弱的差別、TALEs結合位點在基因組中的不同位置以及哺乳動物基因轉錄過程的復雜性等（Boch et al, 2009;Miller et al, 2011; Scholze & Boch, 2010）。但是，這些因素的具體影響尚不明確。另外，由于人工合成的TALE- ADs以單體形式作用，故可以預期其作用特異性低于以二聚體形式作用的 TALENs（見下文）。事實上，首例在擬南芥中將合成 TALE-ADs用于激活目的基因的研究中，共合成了兩個TALE-ADs，并預測了其在擬南芥基因組的四個可能脫靶位點，每個脫靶位點均具兩個堿基錯配，而實驗證明，僅其中一個脫靶位點的轉錄被激活（Morbitzer et al, 2010）。通過改變合成TALEs所識別的核苷酸的序列來研究錯配位點的位置和數(shù)目對TALE活性的影響，Zhang et al（2011）的研究顯示錯配位點數(shù)目與TALE活性成反比。該結論與前人觀察一致，即不同錯配數(shù)目，或不同錯配位置，對TALE活性的影響也不同，即使是單個位點的錯配有時候也會使TALE完全失去活性（Bogdanove et al, 2010）。然而，TALE識別DNA的特異性最有可能是由結合位點的位置、染色質(zhì)狀態(tài)及錯配數(shù)目共同作用決定（Boch et al, 2009; Bogdanove & Voytas,2011; Kay et al, 2009; Romer et al, 2009; Scholze &Boch, 2010; Zhang et al, 2011）。因此，需要對錯配數(shù)目范圍、適合的結合位點位置以及染色質(zhì)狀態(tài)等對TALEs特異性的影響進行深入研究。

3 基于TALENs的基因組靶向編輯

在模式生物中，靶向編輯基因組可有效促進基因插入、敲除和矯正，其關鍵在于在目標位點準確引入雙鏈斷裂（DSB）。產(chǎn)生的DSB能夠通過兩個在真核細胞中高度保守的修復方式進行修復，即非同源末端連接修復（non-homologous end joining,NHEJ）和同源重組修復（homologous recombination,HR）（Urnov et al, 2010）。NHEJ能夠快速有效地重新連接斷裂末端，在該過程中會于連接位點引入小的插入或缺失，從而造成目的基因移碼突變并失去原有功能。而HR需要一個攜帶有斷裂位點兩端遺傳信息的同源DNA臂來實現(xiàn)基因定點矯正（少數(shù)核苷酸的改變）或定點插入一個新基因。這兩種高度保守的DNA損傷修復方式可被用于對體外培養(yǎng)細胞或模式生物進行基因組靶向編輯。要想在特定位點產(chǎn)生DSB就需要具高保真DNA識別和定點切割功能的蛋白，序列特異的類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）正好具備該功能。

與ZFNs相似，TALENs亦為通過將TALE的DNA結合結構域與FokI限制性內(nèi)切酶的非特異性核酸酶結構域融合所產(chǎn)生的能夠被用于基因組靶向編輯的蛋白（圖1c）（Bogdanove& Voytas, 2011;Scholze & Boch, 2011）。DNA結合結構域能夠使TALEN與目標DNA序列結合，然后FokI切割目標DNA并產(chǎn)生DSB。FokI需要形成二聚體以產(chǎn)生活性，因此，通常會設計兩個結合位點很接近的TALENs，以便FokI能夠形成二聚體并在兩個TALENs結合位點之間產(chǎn)生DSB，進而誘使細胞進行定點NHEJ或者HR修復（Bogdanove & Voytas,2011; DeFrancesco, 2011; Li et al, 2011; Scholze &Boch, 2011; Wood et al, 2011; Zhang et al, 2011）。該基因組編輯方式是通過在特定基因組位點引入DSB并誘使細胞對產(chǎn)生的DSB進行預期修復來實現(xiàn)的對基因組準確而有效的遺傳修飾。用于引入DSB的TALENs是人工設計的序列特異核酸內(nèi)切酶，可根據(jù)需要來選擇所要切割的位點。下文將分類討論利用TALENs所進行的成功基因組靶向編輯及其應用。

3.1 基于非同源末端連接的基因敲除

目前，TALENs技術在基因組編輯中最簡單、最廣泛的應用為基因敲除。它利用NHEJ修復過程中引入的不正確插入或缺失來干擾或敲除一個基因或者一個基因組區(qū)段的功能。在過去三年里，該技術已在很多物種以及體外培養(yǎng)細胞中實現(xiàn)了基因定點敲除。

3.1.1 在模式生物中的基因敲除

酵母是第一個成功利用TALENs技術實現(xiàn)基因定點敲除的模式生物（Cermak et al, 2011; Christian et al, 2010; Li et al, 2011）。通過將ZFNs中的DNA識別域替換為兩個研究較為透徹的天然TALEsDNA識別域，即來源于胡椒的病原體Xanthomonas campestris pv.的AvrBs3及來源于水稻病原體X. oryzae pv. Oryzae的PthXo1，產(chǎn)生了能夠識別和切割目標DNA的TALENs。這兩個TALENs在酵母中切割目的DNA的活性可通過LacZ的活性來檢測。結果表明它們都能夠有效切割目標位點，其中PthXo1 TALEN的活性與ZFN陽性對照很接近（Christian et al, 2010）。另一項研究開發(fā)了一種能夠有效組裝TALEN重復序列的方法，同時，還基于自然界中發(fā)現(xiàn)的 TALEs的特性開發(fā)了可用于人工設計TALENs的軟件（Cermak et al, 2011）。研究者還針對15個目標位點制作了30個 TALENs，并在酵母中檢測了這15對TALENs切割目的DNA的能力。結果顯示，與陰性對照相比，這15對TALENs均具顯著切割目的DNA的活性，其中14對的切割活性均不低于ZFN陽性對照活性的25%。

以天然TALE Hax3為骨架針對新的目標位點設計并合成的TALENs及其在煙草葉片中的短暫表達說明，新的TALENs可以在目標位點產(chǎn)生DSB，且所產(chǎn)生的DSB緊接著就會通過NHEJ進行修復（Mahfouz et al, 2011）。

目前TALEN技術也已被成功用于大鼠基因組的靶向敲除（Tesson et al, 2011），這正好可以與此前運用 ZFN技術對大鼠所進行的基因組修飾結果進行比較（Buehr et al, 2008; Cui et al, 2011; Geurts et al, 2009; Li et al, 2008）。通過將不同劑量編碼TALENs的核酸（DNA和mRNA）注射到單細胞大鼠胚胎中來檢測其改變目的基因序列的能力。總體而言，9.5%的注射了DNA的大鼠胚胎和58%的注射了mRNA的大鼠胚胎在IgM位點發(fā)生突變。IgM位點的突變比例是于注射的TALEN劑量相關，最高為75%（注射的mRNA濃度為10 ng/μL及4 ng/μL）。另外，經(jīng)過TALEN技術產(chǎn)生的突變還可通過生殖細胞傳到下一代。與此前運用ZFN技術對大鼠IgM基因進行突變的結果相比（Geurts et al, 2009）, 當以DNA注射時，TALEN技術和ZFN技術的突變比例一致（9%）。然而，當以mRNA注射時，TALEN技術的突變比例（59%）要高于ZFN技術（19%）。另外，以TALEN技術注射的胚胎所得到的新生大鼠個體比例（25%）也高于 ZFN技術（13%）。因此，從某種程度上來說，TALEN技術對大鼠進行基因組編輯的應用要比ZFN技術更具優(yōu)勢（Tesson et al, 2011）。

約一半世界人口均靠水稻養(yǎng)活，但是，由水稻白葉枯菌（X. oryzae）所引起白葉枯病對水稻產(chǎn)量具有很強的破壞性。目前，研究人員已經(jīng)成功利用TALEN技術對白葉枯菌易感基因Os11N3進行了修飾，使水稻對該菌具有了抗性（Li et al, 2012）。白葉枯菌能夠利用自身的 TALEs AvrXa7或者PthXo3，來激活水稻Os11N3基因表達，從而可以利用水稻細胞里的糖分來滿足白葉枯菌自身的營養(yǎng)需求（Antony et al, 2010; Chen et al, 2012）。Os11N3基因的啟動子區(qū)有一個天然TALE AvrXa7的結合位點，該位點與另一個天然TALE PthXo3的結合位點相重疊。研究人員針對這兩個天然TALEs結合位點的重疊區(qū)域設計了TALENs，既可以阻止白葉枯菌的TALEs AvrXa7和PthXo3結合 Os11N3基因的啟動子區(qū)，又不會影響Os11N3基因的正常功能，編碼 TALENs的質(zhì)?？赏ㄟ^根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）轉入到水稻胚胎細胞中。實驗證明TALENs修飾的Os11N3基因不能夠再被白葉枯菌自身的TALEs AvrXa7或者PthXo3所誘導（Li et al, 2012）。

迄今為止，TALEN技術在斑馬魚基因組編輯中的應用最為成功。為檢測TALENs在斑馬魚體細胞中的活性以及比較TALENs和ZFNs在基因編輯中的效率，研究人員針對斑馬魚的兩個內(nèi)源基因，gria3a和hey2，分別設計了3對和1對TALENs。結果顯示這4對TALENs都能夠在目標位點有效引入突變，頻率為11%～33%。該頻率與在同樣位點用ZFNs所得到的頻率相差不大。但是，該研究并未證明由TALENs所引入的突變是否可遺傳（Sander et al, 2011）。另一個研究組發(fā)展了可以組裝任意數(shù)目 TALE重復單元的方法，即“分單元組裝（unit assembly）”，并證明該方法合成的TALENs可在斑馬魚基因組中有效產(chǎn)生可遺傳變異（Huang et al,2011）。一年后，TALEN技術在斑馬魚基因組編輯中的應用得到了進一步完善和簡化（Dahlem et al,2012）。研究人員還發(fā)展了基于Golden Gate克隆來快速組裝 TALE重復單元的方法 （Cermak et al,2011）。同時，另一個研究組發(fā)展了能夠有效、靈敏檢測由TALENs所引入的突變頻率的方法，及高分辨率溶解分析（high resolution melt analysis）。使用該方法，所有注射了TALEN mRNA的斑馬魚胚胎均可在目標位點引入突變，～90%的胚胎能夠發(fā)育成攜帶新突變的成體。基因組上的很多位點都能夠用這種方法引入突變，包括靠近端粒的gol基因及一些不表達的基因位點（Dahlem et al, 2012）。使用經(jīng)改造的Goldy TALEN骨架和斑馬魚遞送系統(tǒng)，改進的TALEN技術可在斑馬魚體細胞和生殖細胞中高效引入定點突變。某些位點的突變頻率～100%，且其中某些個體的兩個等位基因均可被引入突變（Bedell et al, 2012）。

3.1.2 體外培養(yǎng)人類細胞中的基因敲除

目前，已在多種體外培養(yǎng)人類細胞中運用TALEN技術實現(xiàn)了基因定點敲除（Cermak et al,2011; Miller et al, 2011; Mussolino et al, 2011; Reyon et al, 2012; Sanjana et al, 2012）。如前所述，Cermak et al （2011）開發(fā)了能夠有效組裝TALEN重復單元的方法，同時還基于自然界TALEs的特性開發(fā)了用于人工設計TALENs的軟件。為了驗證用這套方法所設計并合成的TALENs在人類細胞中的作用效果，他們針對人 HPRT1基因設計合成了一對TALEN，并用于人胚胎腎細胞（HEK293T）以檢測其在目的基因上引入定點突變的效果。結果表明，這對TALEN能夠在目的基因上通過對染色體上斷裂位點的不準確NHEJ修復方式有效引入突變，共檢測到17種獨立突變類型，包括位于兩個TALEN之間的突變范圍在1～27 bp的替換和缺失。通過體外對天然TALE蛋白AvrBs4的大批突變型活性檢驗，Mussolino et al（2011）建立了能夠高效剪切目的DNA的TALEN骨架，并基于此合成了針對CCR5和IL2RG兩個基因的TALENs。這兩個基因亦為此前在人HEK293T細胞中運用ZFN技術進行基因組編輯的位點，結果顯示，～45%的細胞在目標位點被成功引入突變。TALEN技術在引入突變的效率方面與 ZFN技術相差不大，但細胞毒性顯著降低。Miller et al（2011）也構建了能夠在人K562細胞中有效改變內(nèi)源基因NTF3和CCR5序列的TALEN骨架。首先, 以柑橘黃單胞桿菌（Xanthomonas axonopodis pathovar citri）來源的幾個天然TALEs的結構建立了TALE骨架結構，然后，根據(jù)所構建的 TALE骨架結構針對 NTF3基因設計一對TALEN，并將其在人K562細胞中表達來檢測其在目標位點進行基因修飾的效果。結果觀察到～9%的細胞在目標位點發(fā)生基因突變，在NHEJ修復過程中，TALENs還可在K562細胞的NTF3基因位點引入寡核苷酸雙鏈。他們還在另外一個內(nèi)源基因CCR5證明了TALENs介導的基因修飾，并共針對CCR5基因設計了 4對 TALENs。結果發(fā)現(xiàn)，這 4對TALENs都能夠在K562細胞的CCR5位點有效引入突變，突變頻率＞20%。Sanjana et al（2012）利用分級鏈接原理建立了能夠快速構建 TALEs的方法，該方法可在一周內(nèi)完成TALENs的構建，且可同時構建針對多個位點的TALENs。他們還建立了在哺乳動物細胞內(nèi)檢測所構建TALENs是否具有活性的方法，并使用該方法設計合成了針對人AAVS1基因的TALENs，檢測發(fā)現(xiàn)其能夠在人293FT細胞中對3.6%的細胞進行定點基因編輯。緊接著，Reyon et al（2012）也建立了基于固相連接可自動化控制的高通量構建 TALENs的方法，被稱為FLASH系統(tǒng)。對于組裝大量TALENs來說，F(xiàn)LASH系統(tǒng)既快速又經(jīng)濟。他們在人 U2OS細胞中使用eGFP報告系統(tǒng)檢測了用FLASH系統(tǒng)組裝的48對TALENs的活性。結果顯示，這48對TALENs都能夠在目標位點進行有效基因編輯。他們還用FLASH系統(tǒng)針對 96個可能與癌癥或者表觀遺傳調(diào)控相關的人類內(nèi)源基因組裝了TALENs，在U2OS細胞中檢測發(fā)現(xiàn)其中84對TALENs能夠在目標位點有效引入突變。以上結果顯示，F(xiàn)LASH系統(tǒng)可以使TALEN技術成為有效、快速、高通量的基因組編輯工具，且在目前技術條件下，這是ZFN技術所無法實現(xiàn)的。

3.2 基于同源重組的基因組編輯

TALEN技術的另一個重要應用是當其在基因組上產(chǎn)生雙鏈斷裂以后，可激發(fā)同源重組修復方式修復斷裂雙鏈，并在該過程中，于雙鏈斷裂位置插入一個外源DNA片段。這種基于同源重組的基因組編輯方式除了需要有位點特異的TALENs外，還需要一個攜帶有斷裂位點兩端遺傳信息的同源DNA臂來實現(xiàn)對一個內(nèi)源基因的定點矯正（少數(shù)核苷酸的改變）或者在一個特定的內(nèi)源位點插入一個新基因。

基于同源重組的TALEN基因組編輯技術已在酵母、斑馬魚、體外培養(yǎng)人類細胞以及人多能干細胞中得到了實現(xiàn)（Bedell et al, 2012; Hockemeyer et al, 2011; Li et al, 2011; Miller et al, 2011）。將一對TALENs在酵母細胞內(nèi)表達后，目標位點產(chǎn)生DSB，緊接著通過HR對目標位點進行基因組編輯的效率與ZFNs技術相差不大（Li et al, 2011）。Bedell et al（2012）改進了TALEN系統(tǒng)，并基于該系統(tǒng)，在斑馬魚基因組中成功使用一個DNA寡核苷酸單鏈通過HR方式準確將目標位點DNA序列進行了編輯，同時，還進一步證明該編輯可通過生殖細胞傳遞到下一代。Miller et al（2011） 為證明所建立的TALEN骨架能夠通過HR進行基因組編輯，從24對TALEN中選取通過NHEJ進行基因組編輯時活性最高的兩對來進行驗證，將這兩對TALEN和一個能夠在目標位點插入46 bp核苷酸的供體DNA片段轉入K562細胞，觀察到多至16%的等位基因在目標位點插入了46 bp的供體DNA片段。在人多能干細胞中進行定點基因組編輯是充分發(fā)揮其潛能的前提，為檢測TALEN技術對人胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）和誘導式多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）進行基因組編輯的效率，Hockemeyer et al（2009，2011）針對3個內(nèi)源基因PPP1R12C, OCT4和PITX3設計了TALENs，這3個基因此前也用ZFNs進行過基因編輯。TALEN的表達質(zhì)粒和包含了同源序列的供體質(zhì)粒通過電穿孔法被轉入到ESCs和iPSCs中。共檢測5個基因組位點，結果顯示，在OCT4的第一個外顯子上，67%～100%的細胞在目標位點插入了目的DNA片段，在OCT4的終止密碼子位點為2%～46%，在PPP1R12C位點為～50%，在PITX3基因（該基因在人多能干細胞中不表達）的起始密碼子位點為1%～13%，在PITX3基因的終止密碼子位點為19%～23%。這些效率跟此前用ZFNs對同樣位點進行基因編輯的效率很相近（Hockemeyer et al,2009）。值得注意的是，無論是在多能干細胞中還是在已分化細胞中，TALEN和ZFN技術都能夠在PPP1R12C得到很高的轉基因效率（Hockemeyer et al, 2011）。總之，這些研究說明TALEN技術是進行基于同源重組的基因組定點編輯的有效工具。

雖然用ZFN技術進行基于同源重組的基因定點矯正已在體外培養(yǎng)人類細胞、黑腹果蠅和植物中得到了實現(xiàn)（Urnov et al, 2010）, 但是，運用TALEN技術進行基因定點矯正目前還沒有報道。這種方式是通過TALENs在基因組上的特定位點產(chǎn)生DSB，然后再通過供體DNA片段在目標位點上進行單個或少數(shù)堿基的矯正。該技術可以通過對一些關鍵位點進行點突變來進行基因功能和遺傳性疾病的研究。類似研究已經(jīng)由ZFN技術得到了實現(xiàn)（Urnov et al, 2010）。 基于TALEN技術的基因定點矯正也應該能像ZFN技術一樣有效，但需要在將來的研究中進行驗證。

3.3 TALEN技術在基因組編輯應用中的特異性及其優(yōu)勢

核酸酶的特異性對TALENs的廣泛應用至關重要。通常來說，非特異剪切（脫靶效應）會降低目標位點的基因修飾，并導致細胞毒性。一個脫靶位點的存在就可能導致整個基因編輯的失敗，若用于疾病治療，則可能會產(chǎn)生嚴重副作用?？赡苡捎谠诨蚪M上存在多個脫靶位點而導致的細胞毒性，ZFN技術的發(fā)展和應用已受到了很大制約（Carroll,2008; Mani et al, 2005）。相比之下，TALENs對于其所識別DNA序列的堿基變化具有高度敏感性，3～4個堿基突變即可阻止TALENs與DNA的結合（Boch et al, 2009; Morbitzer et al, 2010; Zhang et al, 2011），即對于TALENs而言，脫靶效應可能很有限。事實上，已有很多針對TALENs脫靶效應的研究，且大部分研究顯示TALENs比ZFNs 具有更高的特異性和更小的細胞毒性。

脫靶效應部分是由TALE蛋白的DNA結合域與DNA的非特異性結合所導致，部分是由FokI核酸內(nèi)切酶的非特異切割所導致。首先，要保證TALENs能夠有效剪切目的 DNA，兩個 TALENs結合位點之間需要有合適的間隔距離以便 FokI能夠形成二聚體，該間隔距離也將影響TALE蛋白與DNA的非特異性結合。根據(jù)不同TALEN骨架結構，已經(jīng)報道的合適間隔距離為 6～40 bp，但是，所有這些TALEN骨架結構的最佳間隔距離為10～30 bp（Christian et al, 2010; Li et al, 2011; Miller et al, 2011;Mussolino et al, 2011）。有功能的間隔距離長度范圍表明，在保證FokI能夠形成二聚體的情況下，設計TALEN蛋白所識別的DNA序列時具有一定的靈活性。根據(jù)Bogdanove & Voytas （2011）的評論，一個包含最短DNA結合結構域和最佳TALE蛋白與FokI之間連接距離的TALEN骨架的間隔距離范圍也較小，從而能夠提高其特異性。然而，通過系統(tǒng)設計和檢測不同識別位點長度TALENs的活性后，并未發(fā)現(xiàn)TALENs識別位點長度與其細胞毒性之間存在負相關（Reyon et al, 2012）。在以EGFP為報告基因的實驗中，較短的 TALENs和較長的TALENs具有同樣的剪切活性，但是，較短的TALENs通常具有較強的細胞毒性。這可能是由于較短的TALENs更可能與非特異性位點結合。這些發(fā)現(xiàn)提示，通過合成更長的 TALENs（例如包含14.5～19.5個重復單元）也許可以把TALENs的細胞毒性降到最低，但該假說需要進一步驗證。其次，重復單元組成可能也會影響TALENs特異性。這是因為同一個核苷酸對不同 RVD的偏好性有差別，而且不同RVDs與其所識別的核苷酸之間的相對親和力也不同。研究提示一個TALE蛋白中應該包含幾個（如3～4個）被適當隔開的親和力較強的RVDs來保其完整活性（Streubel et al, 2012）。如果需要提高G的特異性，應該選擇NH或者NK作為RVDs，但是，如果要提高TALEs的整體效率，就應該選擇NN作為G的RVDs。如果一個TALE蛋白主要由親和力較弱的RVDs（如NI、NG或者NK）組成，設計時就需要更加小心，盡量使它也包含一些親和力較強的 RVDs（如 HD 或 NN）（Streubel et al,2012）。另外，由于FokI要形成二聚體才具有活性，所以要剪切雙鏈DNA就需要有兩個結合位點彼此接近的 TALENs。也就是說，TALENs必須是在成對的時候才具有活性，這就使得TALENs在通常情況下都應該具有很高的特異性。然而，當在一個細胞中表達兩個TALENs的時候，通過FokI的結合能夠使兩個TALENs形成同源和異源二聚體，但是，只有異源二聚體才具有我們需要的特異性。因此，同源二聚體的存在增加了TALENs進行非特異性剪切的可能。為此，已有研究組對FokI進行了改造，使得只有FokI的異源二聚體才具有剪切活性，在一定程度上降低了TALENs的脫靶效應（Doyon et al,2011; Miller et al, 2007）。

雖然 TALENs的脫靶效應還沒有經(jīng)過全面研究，但是，即使和野生型FokI融合，TALENs的細胞毒性相對于ZFNs來說可能較低。將四個酵母菌株分別用TALENs或者ZFNs處理以后進行全基因組序列分析，僅發(fā)現(xiàn)了少數(shù)幾個可能是偶發(fā)的突變位點（Li et al, 2011）。Miller et al（2011）通過捕獲TALENs所結合的DNA片段發(fā)現(xiàn)所捕獲的DNA序列與 TALENs的識別序列一致。人干細胞通過TALEN技術進行基因組編輯以后，研究人員檢測了19個最可能的TALENs脫靶位點，發(fā)現(xiàn)其中的17個都沒有發(fā)生任何變化，剩下的兩個位點的突變率比靶位點分別低169及1 140倍。也就是說，即使有少數(shù)脫靶位點，TALENs在該位點的剪切效率也非常低（Hockemeyer et al, 2011）。比較TALEN和 ZFN技術在人 CCR5基因位點上的編輯效率發(fā)現(xiàn)，TALENs的細胞毒性顯著低于ZFNs，TALENs具有更高的特異性（Mussolino et al, 2011）。在斑馬魚中進行的基因可遺傳敲除實驗表明，9個可能的脫靶位點突變率并沒有高于對照組（Huang et al,2011），TALENs所表現(xiàn)的毒性與ZFNs并沒有顯著差異（Sander et al, 2011），且脫靶效應發(fā)生的頻率非常低，不會對目的基因功能研究產(chǎn)生影響（Dahlem et al, 2012）。大鼠實驗中的9個可能的脫靶位點中，只有一個檢測到突變（Tesson et al,2011）。通過不斷完善檢測 TALENs脫靶效應的技術，也許會發(fā)現(xiàn)更多的脫靶位點（Gabriel et al, 2011;Pattanayak et al, 2011）。就像最近用ZFNs在人多能干細胞中（Yusa et al, 2011）以及用TALENs在酵母中（Li et al, 2011）所做的基因修飾研究一樣，全外顯子組或者全基因組測序?qū)⑹菣z測脫靶位點的有效方法。

4 結 論

TALE蛋白模塊化結構與一一對應DNA識別法為在哺乳動物細胞和模式生物中進行位點特異的轉錄調(diào)控和基因組編輯提供了極具吸引力的解決方案。這種序列特異的DNA結合蛋白能夠特異性與目的DNA結合，而且對于大多數(shù)實驗室來說，可以用經(jīng)濟的分子生物學技術在短短幾天內(nèi)合成所需要的TALE蛋白。盡管如此，TALE蛋白的更廣泛應用仍需對很多問題進一步深入研究。包括TALE蛋白與 ZF蛋白相比具有哪些優(yōu)勢、TALE蛋白與DNA特異性結合的機制、造成TALE蛋白脫靶效應的因素以及在體內(nèi) TALE蛋白與甲基化的 DNA的親和性如何等。TALENs能否像 ZFNs一樣能夠被有效用于臨床實驗也需要進一步研究。從作用機制上來說，需要特別關注表觀遺傳修飾、染色質(zhì)結構以及其他一些DNA結合蛋白的存在是否會影響TALEs的功能和特異性，TALEs與DNA結合的調(diào)控機制目前也不清楚。對TALEs與DNA相互作用的分子基礎的深入研究將有助于提高TALEs在應用上的準確性、特異性和效率。由于TALEs能夠有效地將轉錄激活因子（如VP16）固定在特定內(nèi)源基因的啟動子上來激活目標基因轉錄，因此，其它的一些功能性分子，如重組酶和表觀遺傳修飾酶，也應該同樣可用于對特定位點進行基因組操控?？傊?，基于TALEs的基因組操控技術將為科研人員、臨床醫(yī)師和技術人員提供一種全新的、程序化的和精確的基因組操控技術。

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