田 帥，蒙裕歡，柳明玉，孫 飛，陳軍輝，杜紅麗，王小寧

華南理工大學 生物科學與工程學院，廣州 510006

TRIM5α是TRIM蛋白家族的一員，由TRIM5 初級轉錄產物經過可變剪切產生。人TRIM5α由493個氨基酸組成，具有 RING、B-box2、coiled-coil以及C'末端的B30.2/SPRY等4個結構域。TRIM5α蛋白作為逆轉錄病毒衣殼特異性的限制因子，具有抗HIV-1感染的作用，且由于它能夠在病毒進入細胞后通過阻礙其反轉錄過程來限制病毒感染，故屬于進入后限制作用 (Stremlau et al, 2004; Tang et al,2009)。研究表明，TRIM5α的病毒限制作用與各結構域的結構和功能緊密相關。RING結構域具有E3泛素連接酶功能，能夠促進TRIM5α自身泛素化，增強蛋白與蛋白之間的相互作用(Mische et al,2005)。B-box2結構域為抑制病毒逆轉錄所必須，與TRIM5α同源多聚體的相互作用有關 (Mische et al, 2005)，該區(qū)域在一定程度上能夠通過調節(jié)TRIM5α高度有序的自我裝配而增強對HIV-1的限制作用(Diaz-Griffero et al, 2009)。Coiled-coil功能域對TRIM5α蛋白二聚體的形成和穩(wěn)定有重要作用，只有 TRIM5α同源二聚體才具有抗慢病毒的功能(Stremlau et al, 2004)，且coiled-coil結構域也參與決定抗病毒特異性，對TRIM5α特異性識別和結合病毒衣殼有一定作用(Maillard et al, 2010)。SPRY/B30.2結構域的V1、V2和V3三個可變區(qū)域對病毒衣殼特異性具有重要作用。B30.2區(qū)域的這3個可變區(qū)域均可形成 Loop結構，該結構有利于TRIM5α蛋白與病毒特異性識別與結合 (Ohkura et al, 2006)。該區(qū)域的N端部分對抗HIV-1有決定作用 (Yap et al, 2005)，C末端SPRY/B30.2結構域是抗逆轉錄病毒所必需的，也是識別結合HIV-1衣殼必不可少的關鍵區(qū)域 (Lim et al, 2010)。在HIV-1感染靶細胞的早期階段，細胞內的TRIM5α蛋白通過B30.2結構域與入侵的HIV-1衣殼蛋白相互作用，并且在RING結構域E3泛素連接酶的作用下，通過促進HIV-1脫殼或加速衣殼蛋白降解來阻礙反轉錄過程的順利進行，從而抑制HIV-1后期逆轉錄產物的產生 (Stremlau et al, 2006)。

TRIMCyp蛋白首先在鷹猴 (Aotus trivirgatus)中被發(fā)現(xiàn)，鷹猴體內表達的一種融合蛋白TRIMCyp能夠限制HIV-1感染。TRIMCyp蛋白保留了TRIM蛋白家族N末端的RBCC三模序列，只是TRIM5α蛋白的B30.2結構域被親環(huán)素CypA (Cyclophilin A)代替。在鷹猴中，CypA基因通過逆轉座作用插入TRIM5基因的第 7和第 8外顯子之間，形成TRIM5-CypA融合基因，TRIMCyp同樣通過形成同源二聚體而發(fā)揮限制作用 (Nisole et al, 2004; Sayah et al, 2004)。鷹猴 TRIMCyp以與其他靈長類TRIM5α相似的機制限制 HIV-1感染，都能夠在反轉錄病毒進入靶細胞后的早期階段限制其感染。親環(huán)蛋白CypA是一種肽基脯氨酰異構酶，能夠結合HIV-1衣殼表面富含脯氨酸的回環(huán)結構，這種相互作用增加了人對HIV-1的易感性，同時也增強了非人類靈長類動物限制 HIV-1的活性 (Sokolskaja &Luban, 2006)。TRIMCyp除了在新大陸猴鷹猴體內被發(fā)現(xiàn)以外，也在舊大陸猴體內被發(fā)現(xiàn)，至少4種猴子體內有 TRIMCyp融合蛋白：印度恒河猴(Macaca mulatta)、平頂猴 (Macaca nemestrina)、熊猴(Macaca assamensis)以及食蟹猴(Macaca fascicularis)(Brennan et al, 2008; Cao et al, 2011;Liao et al, 2007; Newman et al, 2008; Virgen et al,2008; Wilson et al, 2008)，這些融合基因均由 CypA基因通過L1介導的逆轉座作用插入TRIM5 基因的3’UTR而形成,它們均能經轉錄和翻譯產生由TRIM5α的2～6號外顯子和完整CypA結構域組成的 TRIMCyp蛋白。恒河猴和平頂猴的 TRIMCyp不能限制HIV-1感染，卻能夠限制HIV-2和FIV的活性(Brennan et al, 2008; Liao et al, 2007; Newman et al, 2008; Virgen et al, 2008; Wilson et al, 2008)。最新研究表明，食蟹猴中的TRIMCyp多態(tài)性具有功能差異 (Dietrich et al, 2011)，TRIMCyp主要單體型(DK)即TRIMCyp融合蛋白CypA結構域中的第66位天冬氨酸(D)和第 143位賴氨酸(K)可限制 HIV-1的作用，但不能限制HIV-2。TRIMCyp次要單體型(NE)即TRIMCyp融合蛋白CypA結構域中的第66位天冬酰胺(N)和第 143位谷氨酸(E)能夠限制HIV-2，卻不能限制HIV-1感染 (Saito et al, 2012a)，兩種單體型功能完全相反，提示TRIMCyp的多態(tài)性對抗病毒效應有一定的影響，因此攜帶TRIMCyp NE單體型的食蟹猴有可能構建成為HIV-1感染的動物模型。

TRIMCyp的等位基因頻率存在地域偏差，雖然食蟹猴 TRIMCyp基因的頻率在東南亞不同國家或地區(qū)已經被初步調查 (Berry et al, 2012; Dietrich et al, 2011; Saito et al, 2012a; Saito et al, 2012b)(表 1)，但是，中國大陸食蟹猴養(yǎng)殖場的 TRIMCyp基因頻率還未被明確闡明，本研究對中國5個省11個養(yǎng)殖場共 1 594個食蟹猴繁殖種群隨機樣本中的TRIMCyp基因頻率進行了篩查研究，以期為進一步開展食蟹猴HIV-1動物模型和HIV-1發(fā)病機制研究奠定基礎。

表1 東南亞不同地區(qū)食蟹猴TRIMCyp等位基因頻率Table 1 Frequency of TRIMCyp alleles of cynomolgus macaques in Southeast Asia

1 材料與方法

1.1 樣品來源與DNA抽提

本研究在廣東、廣西、云南、海南和江蘇5個省 11個養(yǎng)殖場的食蟹猴繁殖種群中隨機采集了 1 594個血樣，EDTA抗凝于-20 ℃保存?zhèn)溆??；蚪MDNA抽提試劑盒購自北京普博生物科技有限公司，按照說明書進行基因組DNA提取。

1.2 引物設計與合成

分別根據TRIM5α第8外顯子和3'UTR序列設計CypA篩查引物，引物為TrimcypF: ATGACTCTG TGCTCACCAAG，TrimcypR：AACTCTAGTCACC CTACTATG，由上海生工生物公司合成。

1.3 PCR擴增及測序

以基因組 DNA為模板，通過 PCR擴增篩查CypA插入情況，并對帶有CypA個體進行測序。PCR擴增所用Taq酶為TaKaRa LA Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司)。反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃40 s，退火溫度59 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。CypA插入片段的測序驗證：回收1 000 bp和1 700 bp的PCR產物凝膠，送交深圳華大基因科技有限公司 (廣州)進行上、下游引物測序。

2 結果

2.1 PCR和測序

PCR擴增結果見圖1，PCR產物凝膠回收后的上、下游引物測序結果與預期序列一致。

圖1 PCR產物電泳情況Figure 1 Electrophoresis image of PCR product

2.2 基因分型和等位基因頻率

從5個省11個養(yǎng)殖場共1 594個食蟹猴樣本統(tǒng)計來看，共有379個個體含有TRIMCyp融合基因，占總數(shù)的 23.78%，其中純合子47個(12.40%)，雜合子332個(87.60%)。TRIM5α和TRIMCyp基因頻率具體結果見表 2。在我們篩查的中國圈養(yǎng)食蟹猴中，TRIM5α基因頻率顯著高于TRIMCyp融合基因頻率，分別是86.64%和13.36%；TRIMCyp融合基因頻率(7.65%～19.79%)高于毛里裘斯食蟹猴的TRIMCyp融合基因頻率(0%)，顯著低于印度尼西亞、菲律賓和馬來西亞各國的 TRIMCyp融合基因頻率(34.85%～100%)，而與印度尼西亞 (Saito et al,2012b)和中印半島食蟹猴 TRIMCyp融合基因頻率無明顯差異(表1)。

表2 中國圈養(yǎng)食蟹猴TRIM5α與TRIMCyp基因頻率統(tǒng)計Table 2 Frequencies of cynomolgus TRIM5 alpha and TRIMCyp genes in China

2.3 TRIMCyp單倍型統(tǒng)計

將含有TRIMCyp融合基因的個體進行CypA測序，并對CypA第66位氨基酸(D/N)和143位氨基酸(K/E)的個體進行統(tǒng)計，結果顯示NE單倍型食蟹猴個體很少，僅20個個體，其中只有一個是NE單倍型純合子(表 3)，且中國圈養(yǎng)食蟹猴 NE單倍型頻率 (4.93%)也顯著低于東南亞三個國家食蟹猴NE單倍型頻率 (11.1%～14.3%)(Saito et al, 2012a)。

表3 中國圈養(yǎng)食蟹猴TRIMCyp DK和NE單倍型頻率Table 3 Frequencies of cynomolgus TRIMCyp haplotypes DK&NE in China

3 討論

本研究初步篩查了我國境內食蟹猴 TRIMCyp融合基因和 CypA單倍型的頻率，而對食蟹猴TRIMCyp融合基因對不同逆轉錄病毒的抗毒效應未進一步研究。靈長類動物 TRIMCyp融合基因從發(fā)現(xiàn)至今，研究者除了對新大陸猴鷹猴 TRIMCyp融合蛋白限制HIV-1復制的作用機制有一定了解以外，舊大陸猴 TRIMCyp融合蛋白不能限制 HIV-1感染的具體機制到現(xiàn)在還沒有確切結論。最近發(fā)現(xiàn)CypA上幾個位點的多態(tài)性會影響TRIMCyp融合蛋白的限制逆轉錄病毒活性，其中CypA結構域中第54位氨基酸的單點突變(H54R)決定了食蟹猴TRIMCyp融合蛋白限制 HIV-1和 FIV的能力(Ylinen et al, 2010)。進一步研究除證實了該結論以外，還發(fā)現(xiàn)TRIMCyp融合蛋白CypA結構域中的第 66位和 143位氨基酸與印度尼西亞食蟹猴TRIMCyp融合蛋白的限制逆轉錄病毒活性密切相關，其中66位為D，143位為K的突變能夠限制HIV-1復制 (Dietrich et al, 2011)。由于不同靈長類動物來源的TRIMCyp融合蛋白在其CypA結構域中的許多氨基酸位點存在差異，導致其 TRIMCyp融合蛋白與不同逆轉錄病毒衣殼蛋白Gag的識別和結合能力也存在差異，繼而導致其抑制活性上的差異 (Cao et al, 2012)。在我國境內含TRIMCyp融合基因的食蟹猴，絕大部分是以TRIM5α/TRIMCyp雜合子的形式出現(xiàn) (87.60%)，在東南亞不同國家或地區(qū)的 TRIM5α/TRIMCyp雜合子頻率是 53.16%；而TRIMCyp的基因頻率甚至高達100%(Philippines)，遠遠高于中國圈養(yǎng)的平均水平 (13.36%)。原因可能是由于前者是建立于1978年的封閉群。同時，Saito et al (2012a)對印度尼西亞食蟹猴的兩次研究顯示不同的 TRIMCyp融合基因頻率 (15.00%和34.85%)，而在毛里裘斯食蟹猴中則未發(fā)現(xiàn)TRIMCyp融合基因。另外，我們發(fā)現(xiàn)在中國圈養(yǎng)的NE單倍型食蟹猴個體極少，NE單倍型頻率(4.93%)也顯著低于東南亞三個國家的食蟹猴NE單倍型頻率 (11.1%～14.3%)。因此，如果需要構建中國圈養(yǎng)食蟹猴HIV-1感染模型的資源群，需要大量篩查中國圈養(yǎng)攜帶 TRIMCyp融合基因的食蟹猴，并根據TRIMCyp單倍型來構建封閉群。另外，研究TRIMCyp不同單倍型與HIV-1和HIV-2感染的相關性，有助于進一步揭示HIV的感染機制。TRIMCyp融合基因的發(fā)現(xiàn)和研究為 HIV-1研究提供策略基礎，為探討TRIMCyp與其他抗HIV-1固有免疫分子的相互關系提供新思路，并為建立更理想的HIV-1/AIDS動物模型提供科學依據。

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