姜?jiǎng)灼?，王黨偉，韓燕國(guó)，張晉瑋，劉桂瓊

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070）

近年來(lái)，雜種優(yōu)勢(shì)在畜牧生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，目前研究主要集中于動(dòng)物生長(zhǎng)和繁殖性能方面[1]。分子標(biāo)記雜合性與動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀間的關(guān)聯(lián)性研究已有大量報(bào)道[2-4]，但基因雜合度對(duì)動(dòng)物血液影響方面研究報(bào)道較少。動(dòng)物血液是機(jī)體重要的內(nèi)環(huán)境，直接參與機(jī)體的新陳代謝、免疫應(yīng)激等復(fù)雜的生理生化過(guò)程[5-6]。血液生化指標(biāo)受遺傳因素影響，從分子水平上對(duì)血液生化指標(biāo)進(jìn)行比較分析具有一定的探索意義，本研究用SNP標(biāo)記估測(cè)個(gè)體基因雜合度，比較不同個(gè)體基因雜合度水平下血液生化指標(biāo)的差異，為探索個(gè)體基因雜合度對(duì)湖北烏羊血液生化指標(biāo)的影響提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)羊均為1.5到2周歲健康無(wú)病的湖北烏羊，共計(jì)107只，選自湖北省通山縣湖北烏羊繁育基地羊群，自由放牧，夜晚補(bǔ)加精料，自由飲水。

1.2 血樣采集及血液生化指標(biāo)測(cè)定

清晨空腹頸靜脈采血，使用一次性血液采集針，采集血液7 mL分兩管，其中4 mL置于37℃水浴自然凝血后，3 500 r·min-1離心分離出血清，立即帶回實(shí)驗(yàn)室在12 h內(nèi)完成各項(xiàng)生化指標(biāo)的測(cè)定，3 mL血液按照文獻(xiàn)[7]提取DNA。

用羅氏P800全自動(dòng)生化分析儀MODULAR-PE（瑞士）對(duì)如下生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Al?anine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspar?tate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、總蛋白（Total protein，TP）、白 蛋 白（Albumin，ALB）、 球 蛋 白（Globulin，GLOB）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglycerides，TG）、磷酸肌酸激酶（Creatine ki?nase，CK）、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）。其中，ALP，CK與LDH使用上海羅氏制藥有限公司試劑盒測(cè)定；ALT、ALP，TG和TC使用中生北控生物科技股份有限公司的試劑盒測(cè)定；TP，GLOB使用長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司的試劑盒測(cè)定，具體操作方法按照相應(yīng)試劑盒推薦的程序完成。

1.3 SNP的篩選及基因分型結(jié)果

1.3.1 SNP引物信息

根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)中的研究成果及本實(shí)驗(yàn)室的積累，收集整理SNP位點(diǎn)，在湖北烏羊群體中進(jìn)行掃描并基因分型，由于某些標(biāo)記可能與湖北烏羊血液生化指標(biāo)存在相關(guān)，因此先統(tǒng)計(jì)分析各標(biāo)記基因型間是否存在差異，如果有則棄之，最終選取13個(gè)SNP標(biāo)記（見(jiàn)表1）來(lái)對(duì)湖北烏羊進(jìn)行雜合度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

表1 13個(gè)SNP的相關(guān)信息Table1 Informmation of 13 SNP sites

1.3.2 基因分型結(jié)果

本試驗(yàn)所選的13個(gè)SNP標(biāo)記位點(diǎn)之中，8個(gè)采用PCR-SSCP分型，6個(gè)采取PCR-RFLP分型，現(xiàn)各選取兩個(gè)PCR-SSCP分型位點(diǎn)和兩個(gè)PCR-RFLP分型位點(diǎn)結(jié)果作為代表。如圖1所示，圖1為IGF-Ⅰ基因部分?jǐn)U增片段，其長(zhǎng)度為363 bp，利用HaeⅢ內(nèi)切酶酶切后瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)3種基因型，3條帶的為363 bp-264 bp-99 bp雜合子個(gè)體；圖2為Mc1R基因部分?jǐn)U增片段，其長(zhǎng)度為167bp，利用HaeⅢ內(nèi)切酶酶切后瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)三種基因型，3條帶的為167 bp-121 bp-46 bp雜合子個(gè)體；圖3、圖4分別為Myf5和INHβA基因部分?jǐn)U增片段，其中PCR-SSCP電泳圖中3條帶的均為雜合子個(gè)體。

圖1 IGF-1基因多態(tài)位點(diǎn)瓊脂糖及PCR-RFLP電泳圖Fig.1 Mutation of IGF-1:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of Primer IGF-1 and PCR-RFLP results

圖2 Mc1R基因多態(tài)位點(diǎn)瓊脂糖及PCR-RFLP電泳圖Fig.2 Mutation of Mc1R:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of Primer Mc1R and PCR-RFLP results

圖3 Myf5基因多態(tài)位點(diǎn)瓊脂糖及PCR-SSCP電泳圖Fig.3 Mutation of Myf5:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of PrimerMyf5and PCR-SSCP results

圖4 INHβA基因多態(tài)位點(diǎn)瓊脂糖及PCR-SSCP電泳圖Fig.4 Mutation of INHβA:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of PrimerINHβAand PCR-SSCP results

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

個(gè)體基因雜合度Hi的計(jì)算：假設(shè)n是山羊基因組內(nèi)所有基因座的取樣，在取樣的n個(gè)基因座位中，雜合座位數(shù)Hl與取樣座位數(shù)n的比值Hi就是個(gè)體基因雜合度，其反映一個(gè)個(gè)體的基因雜合程度[12]。計(jì)算公式如下:

按照個(gè)體基因雜合度以0.15為步長(zhǎng)，將107只湖北烏羊分為4個(gè)雜合度水平，用SAS（V8.1）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同雜合度水平與湖北烏羊的血液生化指標(biāo)進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP基因雜合度

由13個(gè)SNP標(biāo)記計(jì)算出的基因雜合度范圍在0.1538～0.6154，分為4個(gè)水平，結(jié)果見(jiàn)表2。表中平均觀察雜合度較低主要原因是在某些座位上，個(gè)體以純合子為主。

2.2 個(gè)體基因雜合度對(duì)湖北烏羊血液生化指標(biāo)的影響

不同雜合度水平下血液生化指標(biāo)的差異分析見(jiàn)表3，由表可見(jiàn)基因雜合度水平只對(duì)所測(cè)血液生化指標(biāo)中的CK具有顯著影響（P＜0.05），其他血液生化指標(biāo)在4個(gè)雜合度水平下均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。雜合度水平為1（平均雜合度為0.2028）時(shí)，血液生化指標(biāo)CK含量較高平均為306.22 U·L-1，雜合度水平為3（平均雜合度為0.4615）時(shí)，血液生化指標(biāo)CK含量較低平均為234.52 U·L-1。

表2 個(gè)體基因雜合度Table2 Individual gene heterozygosity range for four levels

表3 各個(gè)體基因雜合度水平下湖北烏羊的血液生化指標(biāo)Table3 Hubei Black-boned goat blood biochemical parameters at 4 levels for individual gene heterozygocity

3 討論與結(jié)論

機(jī)體通過(guò)血液循環(huán)將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)送到各組織細(xì)胞中，從而發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控作用以及一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，因此血液生化指標(biāo)某種程度上可以間接反應(yīng)機(jī)體的健康狀況、應(yīng)激和免疫能力。

本研究發(fā)現(xiàn)湖北烏羊血清中CK含量與個(gè)體基因雜合度之間存在倒鐘形曲線關(guān)系，CK含量先隨個(gè)體基因雜合度增加逐漸降低，在雜合度水平3（0.38～0.54）時(shí)，CK含量達(dá)到最低值，此時(shí)隨群體雜合度增加時(shí)CK水平反而會(huì)升高。多重比較表明雜合度水平1與雜合度水平3之間差異顯著（P＜0.05）；CK水平可以反映動(dòng)物的應(yīng)激，CK活性高則表示動(dòng)物受到刺激時(shí)大量表達(dá)，表明該動(dòng)物抗應(yīng)激能力較弱[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)湖北烏羊的最適雜合度水平0.38＜hi≤0.53，說(shuō)明此雜合度下湖北烏羊的抗應(yīng)激能力可能較強(qiáng)。

除CK外，LDH是另一個(gè)與抗應(yīng)激相關(guān)的指標(biāo)。研究表明個(gè)體LDH水平越高，肌肉代謝水平越高，意味著動(dòng)物抗應(yīng)激能力越弱[13-14]。本研究中不同雜合度水平下湖北烏羊血清中LDH含量差異不顯著，但是雜合度水平3 LDH含量（352.12 U·L-1）略低于雜合度水平1（373.45 U·L-1），這與CK含量在雜合度水平1與雜合度水平3之間的變化趨勢(shì)相一致，CK含量低，LDH含量也相對(duì)較低，個(gè)體的抗應(yīng)激能力相對(duì)較強(qiáng)。

GB是體液免疫的主要成分，其含量反映機(jī)體抗病能力。本研究中GB含量隨著雜合度的增加先升高后降低，在雜合度水平3時(shí)最高，更進(jìn)一步揭示在雜合度水平3的情況下，湖北烏羊的抗應(yīng)激能力可能最好，在選種過(guò)程中湖北烏羊個(gè)體基因雜合度最好控制在0.38～0.54水平，此雜合度水平下可能有利于提高湖北烏羊種群的抗應(yīng)激能力使得適應(yīng)性增強(qiáng)。

一般認(rèn)為高雜合度與近交衰退呈負(fù)相關(guān)，與雜種優(yōu)勢(shì)呈正相關(guān)，但基因雜合度與機(jī)體性狀間不是簡(jiǎn)單的相關(guān)關(guān)系[15]。根據(jù)不同雜合度水平分析，不同性狀的適當(dāng)基因雜合度才能保證其最優(yōu)的含量水平或生產(chǎn)能力。

[1]Cam M A,Olfaz M,Soydan E.Body measurements reflect body weights and carcass yields in karayaka sheep[J].AsianJournal of Animal and Veterinary Advances,2010,5(2):120-127.

[2]Lee M,Godshalk E B,Lamkey K R.Association of restricton frag?ment length polymorphisms among maize inbred with agronomic performance of their crosses[J]Crop Science,1989,29:1067-1071.

[3]Dudley J W,Saghai M A,Rufener G K.Molecular marker informa?tion and grouping of parents in corn breeding programs[J].Crop Science,1991,31:718-723.

[4]吳曉林,李栒,Merete Fredholm.連續(xù)雜交下家豬微衛(wèi)星基因雜合度與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性研究[J].遺傳學(xué)報(bào),2001,28(1):20-28.

[5]王勇,張才駿,盧福山.歐拉羊的血紅蛋白多態(tài)性及其與血液指標(biāo)的聯(lián)系[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào),2007(4):61-63.

[6]劉湘帆,王學(xué)峰,樊綺詩(shī).聯(lián)合多個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)進(jìn)行血友病B基因診斷[J].中華血液學(xué)雜志,2002,23(3):147-150.

[7]薩姆布魯克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].金冬雁,黎孟楓,譯.北京:科學(xué)出版社,1992.

[8]王憑青,魯浪,儲(chǔ)明星.孕酮受體多態(tài)性及其與濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)系[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(5):1768-1775.

[9]孫瑞平,王利心,王建剛.山羊LHβ基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)分析[J].西北農(nóng)林科大學(xué)學(xué)報(bào),2009(6):53-55.

[10]張海軍,陳宏,房興唐.山羊MyoD基因家族多態(tài)性及與體尺性狀的相關(guān)性[J].遺傳,2007,29(9):1077-1082.

[11]Liu W J,Fang G X,FangY.The Polymorphism of a Mutation of IGF-1 Gene on Two Goat Breeds in China[J].Journal of Animal and Veterinary Advances.2010,9(4):790-794.

[12]姜?jiǎng)灼?熊遠(yuǎn)著,劉桂瓊.豬個(gè)體基因雜合度對(duì)生產(chǎn)形狀的影響[J].遺傳學(xué)報(bào),2003,30(5):431-436.

[13]Suchint S,Orawan C,Worapol A.Hematological,electrolyte and serum biochemical values of the Thai indigenous chickens(Gallus domesticus)in northeastern Thailand,Songklanakarin[J].J.Sci.Technol.2004,26(3):425-430

[14]Damir?ubcic.Some biochemical parameters in the blood of graz?ing German improved fawn goats from Istria,Croatia[J].Veterinar?ski Arhiv,2001,71(5):237-244.

[15]劉國(guó)慶,孫業(yè)良,楊利國(guó).級(jí)進(jìn)雜交綿羊微衛(wèi)星基因雜合度與生長(zhǎng)性能的關(guān)系[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,29(1):67-71.