毛星剛，章 薇，章 翔

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經外科，陜西 西安 710032)

膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是人類最常見的原發(fā)性腦惡性腫瘤，其發(fā)生年齡較大，平均發(fā)病年齡約62歲。GBM分為原發(fā)性和繼發(fā)性，前者為原位發(fā)生，不表現低度病變惡性前期的征兆;后者由低級別膠質細胞瘤發(fā)展而來。目前認為二者具有不同的發(fā)病機制，絕大多數(95%)GBM屬于原發(fā)性，繼發(fā)性者很少見(5%)。GBM呈現浸潤性生長，瘤細胞向正常腦組織廣泛浸潤，導致手術難以完全切除，且它對放、化療具有一定抵抗性，其中位生存期只有15個月左右。目前針對GBM的治療措施包括手術切除和術后輔以放、化療［1］。GBM的生長特點使其治療后復發(fā)率較高，因而對該類腫瘤生物學特性和分子調控機制研究一直是神經腫瘤學界的熱點課題。

1 GBM臨床及分子特點

典型GBM的MRI影像學表現具有不清晰的邊緣，實體部分信號不均勻(圖1)。其組織學特點是血管增生明顯，壞死區(qū)域細胞可形成假性柵欄樣(pseudopalisading)結構。GBM常見的基因突變包括10 q雜合子丟失(70%)，表皮生長因子受體(EGFR)擴增(36%)，p16INK4A缺失(31%)，PTEN 突變(25%)，p53突變(35%)等。近年來全基因組測序研究認為，GBM中常見的突變主要涉及到3個信號通路［2］:①RTK/RAS/PI(3)K 通路，其突變涉及生長因子受體家族(EGFR、ERBB2、PDGFRA、MET)，NF1，PTEN，RAS，PI(3)K，AKT，FOXO 等;②p53信號通路，其突變與 CDKN2A(ARF)，MDM2，MDM4，TP53等有關;③RB信號通路，其突變與CDKN2A(P16/INK4A)，CDKN2B，CDKN2C，CDK4，CCND2，CDK6，RB1等相關。通常情況下，多數腫瘤的突變涉及到2個或2個以上的通路。

圖1 的頭顱MRI掃描腫瘤位于左額顳葉(箭頭所示)，其影像學特點表現為不清晰的邊緣，實體部分信號不均勻

2 腫瘤干細胞

近年來，腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)理論指出，腫瘤是一種異質性組織，其中腫瘤細胞存在等級關系，一部分細胞具有更強的致瘤能力，稱之為腫瘤干細胞，并可分化為其它非腫瘤干細胞。CSC概念最早在白血病中形成并逐漸成熟［3］，其后在多種腫瘤組織中分離出了 CSCs，包括腦腫瘤［4，5］、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌、前列腺癌、卵巢癌和甲狀腺癌等。

對于CSC的理論在GBM展開了廣泛而深入的研究。許多研究表明，從膠質瘤中可分離出類似正常神經干細胞(neural stem cells，NSCs)的細胞，這些細胞表達干細胞標記物Nestin或CD133，并可分化為神經元及膠質細胞等成熟細胞;這部分的少量細胞即可在免疫缺陷小鼠體內形成腫瘤［4，6］。結合CSC理論，該類細胞被稱之為膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)。目前常用的 GSC標記物是CD133，但針對CD133能否作為GSC的標記物尚存爭議。有研究發(fā)現存在一部分CD133陰性的GSCs，采用其它干細胞標記物(如CD15)可分離出CD133 陰性的 GSC［7，8］。進一步的研究指出，膠質細胞瘤中CD133陽性和陰性的GSC同時存在，這些CD133陽性和陰性的GSC均可產生CD133陽性和陰性的子代細胞［9］，因而提出CD133雖是重要的干細胞分子，但并非特異性的GSC標記物。

另一較常用的GSC標記物分子是CD15，它也是NSC表面標記物。CD15陽性的GBM細胞具有GSC特征，且CD15+細胞在體內較CD15－細胞具有更高的致瘤性。另外，存在部分CD15+CD133－的干細胞，這些細胞同樣具有GSC的特性，包括自我更新、多分化潛能及體內致瘤性等［7，8］。值得注意的是，研究發(fā)現CD15也可作為髓母細胞瘤CSC的標記物［10］，這提示CD15可能是多種組織中共有的干細胞標記物。

3 GSC的分子調控機制

鑒于GSC對GBM致瘤性的重要性，對GSC生物學特征及分子調控機制的研究是目前的重要研究方向之一。GSC的干細胞狀態(tài)維持受到多個分子及信號通路的調控，這些分子及調控通路多與干細胞及多潛能性相關。多個與干細胞相關的分子在GSC呈高表達，可調控GSC的干細胞狀態(tài)，并促進其腫瘤性質的維持。例如GSC通常存在于一個缺氧環(huán)境之中［11～13］，缺氧誘導因子是GSC維持干性(stemness)的重要調節(jié)分子［13］;ZNF217作為分化抑制因子可促進干細胞狀態(tài)的維持，其在GSC高表達并可促進GSC的致瘤性［12］。目前發(fā)現越來越多的干細胞相關因子與GSC的腫瘤干細胞狀態(tài)維持和/或致瘤性有關，包括 SOX2、BMI1、EZH2、MET、PLAGL2、ID1等［14］。另外，與干細胞自我更新及增殖有密切關系的信號通路參與了GSC的干性維持及致瘤性，包括 TGF－β、Notch、Sonic Hedgehog、EGFR、WNT、Stat3、BMP 等［15，16］。這些結果表明，促進干細胞維持及細胞增殖的分子或信號通路活性在GSC中明顯增高。一些研究指出，WNT通路的激活對維持GSC的腫瘤干細胞特征和致瘤性至關重要。因此，深入研究這些分子和通路對GSC的影響，將為進一步了解GSC的生物學特征、制定新的治療策略提供明確的方向。

4 WNT信號通路

WNT通路是細胞增殖、分化、發(fā)育的重要通路［17，18］。在發(fā)現 WNT 與腫瘤關系之前，有關 WNT功能研究主要集中在發(fā)育方面(與生物體節(jié)發(fā)育的關系)。WNT的名稱來源是兩個同源基因Int(integration 1)和Wg(Wingless)的合稱，這兩個基因最初發(fā)現分別與小鼠中樞神經系統(tǒng)發(fā)育及果蠅的翅膀發(fā)育有關。之后陸續(xù)發(fā)現了WNT經典通路各個部分的分子，包括 WNT配體、Frizzled(FZD)受體、LRP共受體、降解復合物、轉錄因子β－Catenin和TCF/LEF等［17，18］。此外，WNT 還可通過不依賴于 β －Catenin的非經典通路(平面細胞極化通路和鈣離子相關通路)發(fā)揮作用。

WNT信號通路是干細胞維持的關鍵通路之一［17，18］。WNT 不僅在多潛能干細胞、NSCs、造血干細胞等多種干細胞的多潛能性中起到關鍵作用，且在多種腫瘤的發(fā)生及CSC的致瘤性中亦起重要作用［18］。經典的WNT通路起始于配體與膜受體的結合，WNT配體分子(WNT3、WNT5A等)與受體(Frizzled，FZD1，FZD7，FZD2，FZD4 等)結合之后，可激活下游通路，導致轉錄因子β－Catenin穩(wěn)定并轉入細胞核，最終通過轉錄調控調節(jié)眾多靶基因的表達。WNT受體未激活時，β－Catenin位于細胞漿內，并與骨架蛋白APC、Axin、激酶CKI和GSK3β形成復合物。在此復合物內，激酶CKI和GSK3β可降解β－Catenin。WNT配體與Frizzled受體家族及LRP5/6/arrow共受體結合后，APC/Axin/CK1/GSK3β降解復合活性受到抑制，從而釋放出β－Catenin，使其在細胞質中聚集并轉入細胞核，與TCF/LEF轉錄因子相互作用而激活下游基因的表達。在β－Catenin未進入細胞核時，TCF/LEF轉錄因子結合于WNT靶基因、并抑制其表達。β－Catenin與TCF/LEF的結合提供了一個激活結構域，這樣可以導致轉錄的激活。

WNT的一個重要調節(jié)分子及受體是LGR孤受體家族(LGR4、LGR5和 LGR6)及其配體 R－spondin(Rspo)蛋白(包括 RSPO1－4)［17，18］。LGR5是重要的干細胞標記物，在多種組織及腫瘤發(fā)生(包括膠質細胞瘤)中發(fā)揮重要作用［17～20］。LGR5可直接與FZD及LRP受體復合物作用，當RSPO蛋白與LGR受體結合后，對FZD及LRP受體復合物產生影響，可增加WNT通路的活性，從而起到調節(jié)WNT 通路活性的作用［17，18］。

與大多數信號通路相類似，WNT通路的激活起始于受體復合物空間構象的變化［18］。大多數信號通路的激活過程多由逐級放大的傳導信號構成(如激酶)。而WNT信號則不同，由于其激活的過程需要將負性調節(jié)因子Axin從降解復合物中分離出來，因而，其信號的激活過程呈現為滴度依賴性，而非逐級放大的級聯反應［18］。WNT的這一特點，也決定了其信號傳導過程調節(jié)的精密性與復雜性。

5 WNT通路在GSC中的調節(jié)作用

WNT通路在干細胞及發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，它與腫瘤的關系，早期較明確的發(fā)現于結腸癌［17，18］。在正常細胞中，其通路活性受到多個水平及分子的嚴密調控，從而確保正常細胞增殖與分化的動態(tài)平衡。而在腫瘤細胞中，WNT通路的某一調控環(huán)節(jié)出現異常，會導致細胞增殖與分化的不平衡。WNT活性分子的過表達或激活突變、WNT抑制因子的失活或失活突變，均會使WNT通路不恰當激活，致使細胞異常增殖而發(fā)生腫瘤。絕大多數結腸－直腸癌患者具有WNT抑制因子APC的失活［21］。作為β－Catenin降解復合物的重要成員，APC失活可導致β－Catenin穩(wěn)定性增加，使進入細胞核內與TCF形成轉錄復合物而激活下游基因。由于WNT通路對腫瘤發(fā)生及干細胞的重要性，近年來，越來越多的研究證明，WNT通路在膠質瘤發(fā)生及GSC的干性維持等多方面發(fā)揮了積極作用［22～24］。

首先，WNT通路中的多個正性及負性調節(jié)因子在膠質細胞瘤中表達異常，提示WNT的異常激活。WNT信號通路的關鍵下游轉錄因子β－Catenin在GBM 中表達增高［25，26］，且其高表達患者預后差［26］。WNT通路激活過程中，β－Catenin在向細胞核的轉入過程依賴于另外一個轉錄因子FoxM1，而FoxM1也高表達于GBM，且其細胞核內表達水平與β－Catenin呈正相關［23］。此外，WNT通路中的多個活性分子均在GBM中高表達，包括配體分子WNT1、WNT2［25］、WNT3A［27］、WNT5 a［25，28］，受 體 分 子FZD2［25］、FZD4［29］、FZD9［30］，WNT 正性調節(jié)分子FRAT1等。同時，WNT通路的很多負性調節(jié)分子在GBM中表達降低或有啟動子區(qū)甲基化，故可促進WNT通路的激活 (如 DKK1、SFRP1、WIF1等)［31，32］。

第二，WNT通路中的多個分子(如正性和負性調節(jié)分子)，可影響GSC的多方面生物學特性。抑制WNT配體分子WNT1、WNT3A可抑制GSC增殖、遷徙能力及其化療的抵抗性，并可抑制其體內致瘤性［27］。沉默 WNT2、WNT3A 及 WNT5可抑制膠質瘤細胞系增殖及體內活性，且它們還可通過PI3K/AKT 通路發(fā)揮作用［25，28］。WNT 受體 FZD4 及與FZD蛋白相關作用的分子DVL，亦系促進GSC腫瘤干細胞性質、侵襲性及體內致瘤性的重要分子［29，33］，并可促進 GSC 上皮細胞間質轉化(epithelial－to－mesenchymal transition，EMT)調節(jié)分子的表達(如 SNAI1、ZEB1、Twist、N－Cadherin 等)［29，34］。影響β－Catenin/TCF轉錄復合物活性的分子PYGO2，也是調節(jié)膠質瘤細胞系增殖的重要分子，其可調節(jié) WNT 靶基因 cyclin D1(CCND1)［35］。WNT 通路的另一正性調節(jié)分子FRAT1也是促進膠質瘤細胞系增殖、侵襲及致瘤性的重要分子［36］。調節(jié)WNT通路活性的干細胞因子 LGR5也參與調節(jié)GSC的腫瘤干細胞性質［19，20］。對于GBM中表達降低的WNT抑制分子WIF1、DKK1等，在GSC及膠質瘤細胞系中過表達此類分子時，可促進WNT通路的激活，并抑制GSC的干性及致瘤性［37，38］。值得注意的是，WIF1可誘導膠質瘤細胞的老化，且WIF1抑制GBM細胞致瘤性及促進其老化的效果是有劑量依賴性的［38］，符合WNT通路激活的滴度依賴性質［18］。WNT通路也是參與GSC放、化療抵抗性的重要信號通路［27，39］。

第三，WNT通路可與多個信號通路及GSC調節(jié)分子相互作用，在腫瘤能量代謝、表觀遺傳學修飾等之間有著密切聯系，并參與對GSC致瘤性的調節(jié)。WNT信號通路具有廣泛的作用，其在GBM尚可受到其它多個分子或信號通路的調節(jié)，如AURKA通過增加β－Catenin的穩(wěn)定性促進GSC的干性維持及致瘤性［40］;WNT可作為癌基因MET的下游通路促進GSC的干性維持及致瘤性［41］;癌基因Moesin可與WNT/β－Catenin相互作用促進GSC的致瘤性［42］。ASCL1可通過抑制DKK1加強WNT通路的激活，從而促進GSC的腫瘤干細胞性質和致瘤性［43］。WNT還與其它信號通路之間有密切的相互作用，如EGFR通路激活可促進β－Catenin聚集并向細胞核內轉移，促進 WNT靶基因表達(如CCND1)［44］。EGFR 對 β －Catenin發(fā)揮作用的效果是通過促進PKM2向核內轉移而達到的［44］。PKM2是參與腫瘤能量代謝(Warburg effect)的關鍵分子，在膠質細胞瘤的發(fā)病機制中起重要作用。PKM2可與組蛋白H3直接作用導致其T11的磷酸化，隨之促使HDAC3從CCND1、MYC等靶基因的啟動子區(qū)解離出來，以及組蛋白H3的K9位乙?；?，進而激活靶基因表達而促進腫瘤的增殖與致瘤性。

6 展望

WNT通路的多成分分子在GBM及GSC中表達異常，且促進WNT激活的分子在GBM及GSC中高表達，可增進GSC的腫瘤干細胞性質及致瘤性;同樣，WNT通路抑制分子可抑制GSC的致瘤性。WNT與其它通路及干細胞相關分子之間的廣泛作用，進一步提示WNT在GSC的中的重要性。這表明WNT通路是抑制GSC、治療GBM的重要靶點。由于WNT通路組成及功能的復雜性，進一步深入探索WNT在GBM及GSC中的作用及機制，以及WNT與其它通路之間的相互關系，將為理解GBM發(fā)病機制、制定以WNT通路為靶點的措施提供實驗理論依據。

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