胡 靜，侯新遠(yuǎn)，尹紹武，祝 斐，賈一何，胡亞麗

（1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210023；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心，廣東 廣州510300）

波紋唇魚(yú)（Cheilinus undulatus）俗名蘇眉，在分類(lèi)學(xué)上隸屬鱸形目（Perciformes）、隆頭魚(yú)科（Labridae）、唇魚(yú)屬（Cheilinus），是一種暖水性魚(yú)類(lèi)，同時(shí)也是體型最大的珊瑚礁魚(yú)類(lèi)之一。分布于非洲東岸、紅海以及印度洋至太平洋中心，在我國(guó)主要分布于南海與東海的南部海域以及臺(tái)灣海域［1-3］。波紋唇魚(yú)為名貴的海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，其肉質(zhì)細(xì)嫩味鮮，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受亞洲人喜愛(ài)［4］。因過(guò)度捕撈及珊瑚礁棲息地破壞等因素，導(dǎo)致自然海區(qū)的波紋唇魚(yú)數(shù)量越來(lái)越少，目前已瀕臨滅絕。1996-2005年間波紋唇魚(yú)曾4度被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）、世界自然基金會(huì)（WWF）等組織和《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）列入瀕危物種名單。因此，應(yīng)加大對(duì)其野生資源的保護(hù)力度，同時(shí)加強(qiáng)和加快對(duì)其種質(zhì)資源的研究，以期對(duì)其進(jìn)行更加合理的開(kāi)發(fā)和保護(hù)。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)波紋唇魚(yú)的研究報(bào)道較少，多集中在該魚(yú)生物學(xué)研究方面［5-8］，而國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)對(duì)其消化系統(tǒng)組織學(xué)研究［9］、不同組織同工酶表達(dá)差異研究［10］、核型分析［11］、營(yíng)養(yǎng)成分分析［12］以及鰓絲結(jié)構(gòu)觀察［13］等方面報(bào)道，未見(jiàn)關(guān)于該魚(yú)種質(zhì)資源方面的研究。近年來(lái)，微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于物種進(jìn)化、生物群體內(nèi)的遺傳變異、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建以及種間關(guān)系甚至生物個(gè)體鑒別等領(lǐng)域［14］。本研究采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)波紋唇魚(yú)4個(gè)野生群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為波紋唇魚(yú)這一瀕危物種的保護(hù)生物學(xué)和資源開(kāi)發(fā)提供更多基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生波紋唇魚(yú)共101尾分別取自海南陵水、馬來(lái)西亞、西沙以及南沙群島附近海域，采樣信息見(jiàn)表1。分別取尾鰭固定在95%乙醇中帶回實(shí)驗(yàn)室，更換兩次95%乙醇后置于-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 波紋唇魚(yú)樣品的基本信息Table 1 Basic information of Cheilinus undulatus samples

1.2 引物合成

從本實(shí)驗(yàn)室自主開(kāi)發(fā)的波紋唇魚(yú)微衛(wèi)星引物中選取15對(duì)，并在5′端按照擴(kuò)增目的片段大小分別標(biāo)記了3種熒光染料：HEX、FAM及TAMRA，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列信息和退火溫度等見(jiàn)表2。

表2 15對(duì)微衛(wèi)星引物信息Table 2 The information of fifteen microsatellite primers

1.3 基因組DNA的提取

對(duì)常規(guī)“酚-氯仿”抽提法［15］稍加改動(dòng)，提取波紋唇魚(yú)尾鰭基因組DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，調(diào)整濃度至50 ng／μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)

用合成的15對(duì)熒光引物對(duì)波紋唇魚(yú)4個(gè)群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2μL，1.5 μL 25 m M MgCl2，2μL 25 m M d NTP，正向引物F和反向引物R各1μL，taq酶0.2μL，DNA 模板為1μL，雙蒸水11.3μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min后，94℃30s，退火（溫度見(jiàn)表2）30s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃5 min，4℃保溫。以8%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳結(jié)合銀染法檢測(cè)PCR產(chǎn)物，如位點(diǎn)T462的部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見(jiàn)圖1，將擴(kuò)增目的條帶清晰的PCR產(chǎn)物在ABI 3500XL基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，檢測(cè)產(chǎn)物片段大小。

圖1 位點(diǎn)T462的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification profile of the primer T462

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用軟件Gene Mapper 4.1分析讀取毛細(xì)血管電泳片段長(zhǎng)度后，利用群體遺傳多樣性分析軟件POPGEN32分析計(jì)算每個(gè)群體及整體水平上的有效等位基因數(shù)（Ne）、平均觀測(cè)雜合度（Ho）、平均期望雜合度（He）及Nei's遺傳相似指數(shù)［16］和遺傳距離，并采用UPGMA法構(gòu)建群體間的系統(tǒng)樹(shù)；PIC-CALC 0.6計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）；最后由遺傳分化分析軟件Areliquin3.1［17］計(jì)算出遺傳分化參數(shù)并對(duì)群體的遺傳變異進(jìn)行AMOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1 SSR擴(kuò)增結(jié)果

本研究所用15對(duì)微衛(wèi)星引物在4個(gè)波紋唇魚(yú)群體中均能穩(wěn)定擴(kuò)增，等位基因數(shù)為3～16個(gè)，平均每對(duì)引物產(chǎn)生9個(gè)等位基因。其中A3位點(diǎn)在馬來(lái)西亞群體中獲得的等位基因數(shù)最少（3個(gè)），位點(diǎn)B30（2）在南沙群體中獲得的等位基因數(shù)最多（16個(gè)），擴(kuò)增片段在110～289 bp之間（表3）。

表3 15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果Table 3 The results of amplification of fifteen microsatellite loci

2.2 群體的遺傳多樣性分析

15對(duì)微衛(wèi)星引物在4個(gè)波紋唇魚(yú)群體中共檢測(cè)到246個(gè)等位基因，其中陵水群體（LP）131個(gè)，馬來(lái)西亞群體（MP）140個(gè)，西沙群體（XP）114個(gè)，南沙群體（NP）160個(gè)。分析4個(gè)野生波紋唇魚(yú)群體的等位基因數(shù)、期望雜合度（He）、觀測(cè)雜合度（Ho）、多態(tài)信息含量（PIC）和Shannon's信息指數(shù)結(jié)果（表4）表明，馬來(lái)西亞群體的各遺傳多樣性參數(shù)最高，而平均等位基因數(shù)（Na）、平均有效等位基因數(shù)（Ne）、平均多態(tài)信息含量（PIC）和平均Shannon's信息指數(shù)（I）均以西沙群體最低，分別為7.467，3.876，0.669和1.551，平均觀測(cè)雜合度（Ho）和平均期望雜合度（He）則以南沙群體最低（0.443和0.712）?？傮w分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)波紋唇魚(yú)群體的各遺傳變異參數(shù)均較高，PIC均＞0.5，說(shuō)明這些海域的野生波紋唇魚(yú)仍具有較高的遺傳多樣性水平。

表4 4個(gè)波紋唇魚(yú)群體的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of four C.undulatus groups

2.3 群體間的遺傳距離和聚類(lèi)分析

基于Nei's遺傳距離構(gòu)建4個(gè)波紋唇魚(yú)群體的UPGMA系統(tǒng)樹(shù)（圖2），結(jié)果顯示陵水群體與馬來(lái)西亞群體的親緣關(guān)系最近，首先聚為一支，然后與西沙群體聚在一起，最后再與親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的南沙群體聚在一起。Nei無(wú)偏倚遺傳距離范圍為0.145 7～0.226 1，遺傳相似度范圍0.766 7～0.864 4（表5），其中陵水群體與馬來(lái)西亞群體的遺傳距離最?。?.145 7），遺傳距離最大的為南沙群體和馬來(lái)西亞群體（0.226 1）。

圖2 4個(gè)波紋唇魚(yú)群體的UPGMA系統(tǒng)樹(shù)Fig.2 UPGMA tree of four C.undulatus groups

表5 4個(gè)波紋唇魚(yú)野生群體的遺傳相似指數(shù)與遺傳距離Table 5 Nei's genetic identity and genetic distance of four C.undulatus groups

2.4 遺傳變異和基因流

用Arlequin3.1軟件對(duì)4個(gè)波紋唇魚(yú)群體進(jìn)行AMOVA遺傳變異方差分析（表6），結(jié)果表明，波紋唇魚(yú)60.90%的遺傳變異來(lái)自于個(gè)體間，35.75%的遺傳變異來(lái)自于群體內(nèi)個(gè)體間，僅有4.15%的遺傳變異來(lái)自于群體間，說(shuō)明波紋唇魚(yú)的遺傳變異主要來(lái)自于群體內(nèi)部，且變異水平較高。由Arlequin3.1軟件生成的群體間的遺傳分化系數(shù)（Fst=0.373 0）［18］及其計(jì)算所得基因流數(shù)值（Nm=0.840 5）來(lái)看，波紋唇魚(yú)群體間存在顯著地基因交流障礙并且群體可能由于遺傳漂變而發(fā)生了分化［19］。

表6 基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的波紋唇魚(yú)4個(gè)群體AMOVA分析Table 6 The AMOVA analysis of the four C.undulatus populations in microsatellite loci

3 討 論

3.1 波紋唇魚(yú)的遺傳多樣性

群體的遺傳多樣性高低是判斷一個(gè)生物物種適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力的重要依據(jù)。豐富的遺傳多樣性是一個(gè)物種具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和較大的生物進(jìn)化潛力以及豐富的育種和遺傳改良能力的重要特征，并對(duì)種質(zhì)鑒定和親本選擇具有重要的意義［20-21］。有效等位基因數(shù)是基因純合度的倒數(shù)，能反映基因座等位基因間的相互作用［22］。平均雜合度、PIC、Shannon's信息指數(shù)也是目前衡量遺傳多樣性的重要指標(biāo)。本研究中，陵水群體、馬來(lái)西亞群體、西沙群體和南沙群體的平均有效等位基因分別為4.114，4.887，3.876，4.243；平均觀測(cè)雜合度（平均期望雜合度）分別為0.520（0.727），0.531（0.736），0.457（0.724），0.443（0.712）；平均多態(tài)信息含量分別為0.687，0.696，0.669，0.673，均＞0.5；平均Shannon's信息指數(shù)分別為1.620，1.705，1.551，1.675。從上述4個(gè)指標(biāo)可以看出，4個(gè)不同地理海域的野生波紋唇魚(yú)群體均具有豐富的遺傳多態(tài)性，蘊(yùn)藏著較大的進(jìn)化潛力，且以馬來(lái)西亞群體最高。因此，通過(guò)對(duì)野生波紋唇魚(yú)遺傳多樣性的分析來(lái)評(píng)價(jià)自然災(zāi)害、環(huán)境污染、人為因素等對(duì)其種質(zhì)資源所帶來(lái)的遺傳學(xué)影響，對(duì)尋找科學(xué)合理的開(kāi)發(fā)保護(hù)途徑具有重要的意義。

3.2 波紋唇魚(yú)群體間的親緣關(guān)系和遺傳分化

遺傳距離是研究物種遺傳多態(tài)性的基礎(chǔ)，常用來(lái)描述品種（系）的遺傳結(jié)構(gòu)、品種間的差異與遺傳關(guān)系［23］。本研究通過(guò)4個(gè)波紋唇魚(yú)群體的遺傳距離研究發(fā)現(xiàn)，海南陵水群體與馬來(lái)西亞群體的遺傳距離最?。?.145 7），先聚為一支，然后與西沙群體聚在一起，南沙群體與其它3個(gè)群體的遺傳距離較遠(yuǎn)，獨(dú)立一支。這種導(dǎo)致遺傳距離遠(yuǎn)近與地理距離不一致現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是：1）與南沙海域樣品采集地點(diǎn)偏遠(yuǎn)有關(guān)；2）與本研究所采用的分子標(biāo)記技術(shù)有關(guān)。因此，要闡明遺傳距離與地理距離的確切關(guān)系，還需結(jié)合其它分子標(biāo)記對(duì)更多地點(diǎn)的樣本做進(jìn)一步分析。

Fst作為分化系數(shù)可用于分析群體遺傳結(jié)構(gòu)，Shaklee［24］指出若固定指數(shù)Fst在0～0.05之間，說(shuō)明群體間的遺傳差異很小；若Fst在0.05～0.15之間，說(shuō)明群體間存在中等程度的遺傳差異；若Fst在0.15～0.25之間，說(shuō)明群體間的遺傳差異比較大；若Fst＞0.25，則說(shuō)明群體間的遺傳差異很大。通過(guò)對(duì)波紋唇魚(yú)群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析（表6）表明，本研究中的4個(gè)波紋唇魚(yú)群體并不是一個(gè)無(wú)分化的大群體族群，而是各群體遺傳差異很大（Fst=0.373 0）且遺傳物質(zhì)非均勻分布的族群。其中，60.90%的遺傳變異來(lái)自于個(gè)體間，35.75%的遺傳變異來(lái)自于群體內(nèi)個(gè)體間，僅有4.15%的遺傳變異來(lái)自于群體間，也充分驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

根據(jù)群體遺傳學(xué)理論，基因流越順暢，遺傳分化的程度將越低［25］。Slatkin［26］和 Hamrick等［27］認(rèn)為，若每代遷入個(gè)體數(shù)Nm＞1，基因流就足以抵制遺傳漂變的作用，也同時(shí)防止了群體分化的發(fā)生；若Nm＜1，基因流不足以抵制群體內(nèi)因漂變引起的遺傳分化，即有限的基因流可以促使群體發(fā)生遺傳分化。本研究得出波紋唇魚(yú)4個(gè)野生群體Nm=0.840 5，說(shuō)明遺傳漂變對(duì)波紋唇魚(yú)的遺傳結(jié)構(gòu)有重要影響。遺傳漂變會(huì)造成一些等位基因的丟失和另一些等位基因的固定，從而引起同一物種對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)，再通過(guò)生存空間的擴(kuò)展，形成物種的微進(jìn)化［28］。因此，遺傳漂變對(duì)本研究中波紋唇魚(yú)群體遺傳分化的影響不容忽視。當(dāng)然，波紋唇魚(yú)這種分化格局的出現(xiàn)還可能與其種群數(shù)量急劇減少、活動(dòng)范圍相對(duì)狹窄、氣候環(huán)境劇變、地質(zhì)結(jié)構(gòu)變化等多種因素有關(guān)，有待進(jìn)一步考證。

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