宓妍妍，王 燕，黃曉航，劉晨臨＊

（1.山東輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南250353；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061）

DEAD-box RNA解旋酶能介導(dǎo)NTP依賴的雙鏈RNA解旋，利用ATP依賴的RNA酶催化RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，在許多RNA參與的代謝活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。DEAD-box RNA解旋酶參與RNA轉(zhuǎn)錄、前體mRNA剪切、核糖體發(fā)生、核質(zhì)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)翻譯和RNA降解等重要的生命活動(dòng)，廣泛存在于從病毒到人類幾乎所有已知的生命形式中［1］。

越來越多的研究表明，DEAD-box RNA解旋酶參與植物細(xì)胞中的各種代謝過程，具有廣泛的生理意義，并且在對(duì)逆境的適應(yīng)中具有重要作用［2］。2000年，Chamot等［3］在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)了一些冷誘導(dǎo)的基因，RNA解旋酶基因就是其中之一［4-7］。除溫度以外，RNA解旋酶基因還受光照、氧氣和滲透壓等條件變化的影響［8］。2005年，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)1個(gè)DEAD-box RNA解旋酶基因發(fā)生突變，這個(gè)DEAD-box RNA解旋酶與m RNA輸出、植物發(fā)育和逆境反應(yīng)有關(guān)系［9］。集胞藻PCC6803只有1個(gè)RNA解旋酶基因，即crh R（sir0083），它的表達(dá)也受低溫誘導(dǎo)，還在一定程度上受組氨酸激酶基因hik33的影響［2，7］。研究表明，crh R突變使groES，groEL1和groEL2分子伴侶基因的轉(zhuǎn)錄不受低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)［8］。RNA解旋酶可能直接或間接地影響某些酶或蛋白質(zhì)的合成，因而在生物的逆境適應(yīng)過程中發(fā)揮作用。

本研究從南極分離到一株嚴(yán)格嗜冷的海冰衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L，嚴(yán)酷的極地生境造就了生活在海冰環(huán)境中的真核光合微藻（冰藻）獨(dú)特的生物學(xué)特性。在南極海冰的形成、生長(zhǎng)和融化的季節(jié)性變化中，冰藻也經(jīng)受了溫度、光照等生態(tài)條件的劇烈變化。溫度和鹽度是影響海冰中冰藻種類生存的主要因素，Chlamy domonas sp.ICE-L對(duì)低溫、高鹽等逆境具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，受正常海水3倍的鹽度變化，其最適生長(zhǎng)溫度為4～10℃。目前對(duì)DEAD-box RNA解旋酶基因的研究主要集中在人類，以及玉米，水稻，藍(lán)藻和集胞藻等植物方面，對(duì)于極地浮游植物的研究還很少。

本研究通過對(duì)篩選到的1條南極冰藻DEAD-box RNA解旋酶CiDDX5基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并研究其在低溫、高鹽環(huán)境中表達(dá)量的變化，探尋DEAD-box RNA解旋酶基因的功能，為揭示南極冰藻在低溫、高鹽環(huán)境中的適應(yīng)機(jī)制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L分離自由中國(guó)極地研究所（上海）提供的南極中山站（69°S，77°E）附近的浮冰中。采用Provasoli培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度7℃，光照強(qiáng)度1 300～1 600 lx，光照周期12 h／12 h L／D。南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L的RNA解旋酶基因序列來自于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的南極衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L EST文庫(kù)，測(cè)序由上海桑尼生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 DEAD-box RNA解旋酶基因的生物信息學(xué)分析

DEAD-box RNA解旋酶CiDDX5基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）分析通過NCBI網(wǎng)站（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行，用DNAStar軟件包中的EditSeq軟件預(yù)測(cè)蛋白的理論分子量和等電點(diǎn)。通過 SWISS-MODEL［10-12］（http：／／swissmodel.expasy.org／）網(wǎng)站預(yù)測(cè) RNA 解旋酶基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

將測(cè)定的CiDDX5基因序列用BLAST軟件與GenBank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）中已知的其他RNA解旋酶基因序列進(jìn)行比對(duì)。選取相似性較高的序列［13］用BioEdit軟件進(jìn)行對(duì)位排列，人工校正和合并序列。用MEGA 4.0［14］軟件分析中的緊鄰法（neighbor-joining method，NJ）推測(cè)系統(tǒng)關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自展檢測(cè)法（bootstrap test）估計(jì)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性，重復(fù)次數(shù)為1 000次。

運(yùn)用DNAStar軟件將Chlamydomonas sp.ICE-L的CiDDX5基因和其它3個(gè)遺傳距離較近的綠藻DEAD-box RNA解旋酶基因進(jìn)行氨基酸序列同源性分析。

1.3 CiDDX5基因定量表達(dá)分析

1.3.1 樣品處理

低溫脅迫處理，在-20℃避光條件下，將7℃培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期南極冰藻Chlamy domonas sp.ICE-L樣品分別處理0.5，1，3，6和12 h。以7℃避光處理0 h和12 h的混合樣品作為對(duì)照。

高鹽脅迫處理，將正常海水鹽度（33）培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L樣品濃縮后置于3倍海水鹽度（99）的培養(yǎng)基中，正常光照條件下分別處理0.5，1，3，6和12 h，以正常鹽度海水培養(yǎng)0 h和12 h的混合樣品作為對(duì)照。

樣品離心收集，液氮迅速冷凍后放入-80℃冰箱保存。分別用液氮研磨后立即進(jìn)行RNA提取。

1.3.2 RNA提取

采用CTAB法［15］提取南極冰藻ICE-L的總RNA：1）將研磨好的藻樣加到600μL CTAB裂解液（2 g CTAB，1 g PVP，0.585 g EDTA，8.182 g NaCl，100 m L DEPC處理水）中，60℃水浴10 min；2）加入等體積的氯仿-異戊醇（24：1，V／V），抽提兩次，4℃，13 000 rpm離心10 min；3）加入1／4體積10 mol／L的LiCl溶液，-20℃沉淀2～3 h；4）用75%乙醇洗滌沉淀兩次，加入30μL DEPC處理水溶解沉淀；5）用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的質(zhì)量并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提RNA的濃度和OD260／OD280。

提取出的RNA用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物科技有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用于實(shí)時(shí)定量PCR。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR

根據(jù)南極冰藻ICE-L的CiDDX5基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)所需特異性引物，并由北京市理化分析測(cè)試中心代為合成。選擇磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH和核糖體蛋白R(shí)LP19這兩對(duì)基因作為本次實(shí)驗(yàn)的參比基因，引物序列見表1。

在熒光定量PCR儀（Mx3000，美國(guó)Stratagene公司）上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。反應(yīng)體系為10μL，反應(yīng)程序：95℃5 min；95℃10 s，63℃20 s，72℃20 s，40個(gè)循環(huán)；循環(huán)后升溫至95℃，再降至63℃，以0.5℃遞增至95℃。

將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)值取3次重復(fù)的平均±SE，通過2-ΔΔCt方法［16］計(jì)算低溫和高鹽條件下不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)ICE-L的CiDDX5基因表達(dá)的影響。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 The primers of Real-Time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 CiDDX5基因的序列分析

測(cè)序分析表明，CiDDX5基因全長(zhǎng)為2 077 bp，含有1個(gè)完整的開放閱讀框，編碼513個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白的理論分子量為74.5 k Da，等電點(diǎn)為9.14。

將預(yù)測(cè)的CiDDX5氨基酸序列進(jìn)行Protein Blast分析發(fā)現(xiàn)其含有DEAD-box解旋酶的保守結(jié)構(gòu)域和解旋酶超家族C端的保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。

圖1 Blast分析CiDDX5基因可能含有的功能域DEADc：DEAD-box解旋酶的保守結(jié)構(gòu)域；HELICc：解旋酶超家族C端的保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 Potential functional domains of the CiDDX5 gene by Blast analysis DEADc：DEAD-box helicase domain；HELICc：Helicase superfamily C-terminal domain

2.2 CiDDX5基因的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

將ICE-L的CiDDX5的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其與數(shù)據(jù)庫(kù)中，來自人類的2種解旋酶Ddx5（P68）和Ddx3x的功能蛋白相似度最高。分別達(dá)到49%和41%，具有同源模建的意義。表2中a和b兩個(gè)肽段的功能分別為鎂輔因子和ATP結(jié)合位點(diǎn)。

表2 預(yù)測(cè)CiDDX5所含兩個(gè)肽段的信息Table 2 The information of two predicted peptides of the CiDDX5

2.3 CiDDX5氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

從構(gòu)建的CiDDX5序列的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，綠藻、高等植物和真菌分別構(gòu)成了3個(gè)獨(dú)立的分支，CiDDX5蛋白序列與萊茵衣藻，團(tuán)藻和膠球藻等綠藻的相關(guān)序列聚類在一起，說明CiDDX5的蛋白結(jié)構(gòu)與其所屬物種的分類地位是相關(guān)的（圖2）。

圖2 CiDDX5序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of CiDDX5 sequence constructed by the neighbor joining method

2.4 CiDDX5氨基酸序列同源性分析

運(yùn)用DNAStar軟件將CiDDX5氨基酸序列和3種綠藻的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，從分析結(jié)果可看出ICE-L與萊茵衣藻，團(tuán)藻和膠球藻的同源性較高，分別為66%，65%和64%。將ICE-L的CiDDX5的氨基酸序列與其它3種單細(xì)胞綠藻的RNA解旋酶蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其編碼DEAD-box RNA解旋酶特有的9個(gè)保守的氨基酸基序（圖3），說明CiDDX5屬于DEAD-box RNA解旋酶。但是，CiDDX5蛋白中的保守氨基酸基序與其它綠藻的DEAD-box RNA解旋酶的保守序列不完全一致。在所有9個(gè)保守基序中Motif Q的保守性最差，4種不同綠藻的Motif Q均有不同組成的氨基酸。CiDDX5的保守基序MotifⅧ是YIHRLGRTGR，其它綠藻的均為YVHRIGR。

圖3 ICE-L CiDDX5和3種不同DEAD-box RNA解旋酶氨基酸序列同源性分析Fig.3 Amino acid sequence comparison ICE-L CiDDX5 and other representative DEAD-box RNA helicases.

2.5 CiDDX5基因定量表達(dá)分析

在-20℃冰凍脅迫條件下，南極冰藻經(jīng)不同時(shí)間的處理過程后，CiDDX5基因的表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化（圖4）。隨著處理時(shí)間的延續(xù)，該基因的表達(dá)量逐漸升高，處理3 h時(shí)，CiDDX5基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，此時(shí)表達(dá)量為未經(jīng)低溫處理組的1.8倍，之后開始降低；在處理12 h后，CiDDX5基因的相對(duì)表達(dá)量降為對(duì)照組的一半。

圖4 -20℃ 低溫脅迫下CiDDX5基因的定量表達(dá)Fig.4 The quantitative expression of the CiDDX5 gene under low temperature stress of-20℃

檢測(cè)經(jīng)過3倍鹽度培養(yǎng)處理的冰藻CiDDX5基因表達(dá)量的變化，其實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果見圖5。在高鹽脅迫下CiDDX5基因的表達(dá)量持續(xù)升高，在6 h處理后表達(dá)量達(dá)到最大值，為對(duì)照組的2.9倍，在12 h略有降低。在所選取的處理時(shí)間段內(nèi)，處理組基因的表達(dá)量都是高于對(duì)照組。表明在高鹽脅迫下，CiDDX5基因的表達(dá)量較低溫處理?xiàng)l件下發(fā)生了更為明顯和持久的變化，提示該基因在冰藻應(yīng)對(duì)高鹽脅迫方面可能發(fā)揮更重要的作用。

圖5 3倍鹽度脅迫下ICE-L DEAD-box RNA解旋酶基因的定量表達(dá)Fig.5 The quantitative expression of the CiDDX5 gene under salinity stress of 3 times

3 討 論

越來越多的研究表明，植物中RNA解旋酶的表達(dá)受到各種生物和非生物脅迫的影響［2，8，15-16］。在本研究中，克隆得到了南極冰藻Chlamydomnas sp.ICE-L的RNA解旋酶CiDDX5基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并研究了冰藻的該基因在低溫和高鹽脅迫下表達(dá)量的變化。

解旋酶是存在于原核生物和真核生物中的一個(gè)龐大蛋白類群，分為5個(gè)（超）家族，即SF1～5。DEAD-box RNA解旋酶屬于SF2家族成員［2］，根據(jù)保守的DEAD模體的序列差異分為DEAD，DEAH，DECH和DEVH類群，這些類群的蛋白中均包含特征性的保守基序結(jié)構(gòu)［2］。CiDDX5蛋白中包含了所有9個(gè)保守性模體結(jié)構(gòu)，因而可以推定它是DEAD-box RNA解旋酶蛋白。DEAD-box RNA解旋酶蛋白中的保守基序與其生化功能有密切關(guān)系，其中Motif V和MotifⅧ共同參與ATP的水解，而模體Ⅵ則與RNA的解鏈有關(guān)。CiDDX5中的模體V為DEAD，而模體Ⅵ為SAT，這與DEAD類群的DEAD-box RNA解旋酶蛋白中的模體序列相一致。

在植物中DEAD-box RNA解旋酶的表達(dá)受到生物以及非生物條件的影響。在低溫脅迫下Av DH1和STRS1的表達(dá)可能在早期調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮作用；而在高鹽脅迫下上述兩基因的表達(dá)可能起到長(zhǎng)期調(diào)節(jié)的作用［17-18］。從本研究中可以看出，低溫脅迫下CiDDX5基因的表達(dá)量在處理3 h時(shí)達(dá)到了最大值；而在高鹽脅迫下，在處理12 h時(shí)基因仍具有很高的表達(dá)量。以上研究結(jié)果與Liu等［19］在高等植物中所做的研究結(jié)果相一致。

Gong等［20］發(fā)現(xiàn)在冷脅迫的條件下，DEAD-box RNA酶缺陷型的植物中，mRNA在從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)的過程中受損。Zhu等［21］研究結(jié)果表明，RNA代謝過程的調(diào)節(jié)對(duì)于植物的低溫適應(yīng)是非常重要的，DEAD-box RNA解旋酶在生理調(diào)節(jié)方面的重要作用。藍(lán)藻中DEAD-box RNA解旋酶的有關(guān)研究表明，crh R編碼的RNA解旋酶可能通過改變mRNA的構(gòu)象，影響其在低溫下的穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)水平；這種對(duì)二級(jí)構(gòu)象的調(diào)節(jié)可能是某些mRNA在低溫下指導(dǎo)蛋白合成所需要的。對(duì)擬南芥的相關(guān)研究表明，低溫脅迫下At RH25和At RH9兩種RNA解旋酶的表達(dá)都會(huì)發(fā)生上調(diào)。本研究初步揭示了CiDDX5在南極冰藻低溫、高鹽環(huán)境脅迫下表達(dá)量的變化，分析了其可能的分子作用機(jī)制。在今后的研究里，還需要進(jìn)一步對(duì)其是否是ATP依賴型、其受到脅迫的信號(hào)調(diào)節(jié)分子是什么，以及其靶向作用的m RNA的類型等方面進(jìn)行更為深入的研究，以期加深對(duì)南極冰藻RNA解旋酶的了解，進(jìn)一步揭示南極冰藻在極端環(huán)境條件下的適應(yīng)機(jī)制。

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［1］ HALL M C，MATSON S W.Heliease motifs：the engine that powers DNA unwinding［J］.Molecular Microbiology，1999，24（5）：867-877.

［2］ VASHISHT A A，TUTEJA N.Stress responsive DEAD-box helieases：a new pathway to ngineer plant stress tolerance［J］.Journal of Photochemistry and Photobiology.B，Biology，2006，84：150-160.

［3］ SUZUKI I，KANESAKI M K，MIKAMI K，et al.Cold-regulated genes under control of the cold sensor Hik33 in Synechocystis［J］.Molecular Microbiology，2001，40（1）：235-244.

［4］ CHAMOT D，MAGEE W C，YU E，et al.A cold shock induced cyanobacterial RNA helicase［J］.Journal of Bacteriology，1999，181：1728-1732.

［5］ CHAMOT D，OWTTRIM G W.Regulation of cold shock-induced RNA helicase gene expression in the cyanobacterium Anabaena sp.strain PCC 7120［J］.Journal of Bacteriology，2000，182（2）：1251-1256.

［6］ VINNEMEIER J，HAGEMANN M.Identification of salt-regulated genes in the genome of the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803 by subtractive RNA hybridization［J］.Atchives of Microbiology，1999，172（6）：377-386.

［7］ MIKAMI K，KANESAKI Y，SUZUKI I，et al.The histidine kinase Hik33 perceives osmotic stress and cold stress in Synechocystis sp.PCC 6803［J］.Molecular Microbiology，2002，46（4）：905-915.

［8］ OWTTRIM G W.RNA helicases and abioti stress［J］.Nucleic Acids Research，2006，34（11）：3220-3230.

［9］ CHAMOT D，COLVIN K R，KUJAT-CHOY S L，et al.RNA structural rearrangement via unwinding and annealing by the cyanobacterial RNA helicase，CrhR［J］.The Journal of Biological Chemistry，2005，280：2036-2044.

［10］ ARNOLD K，BORDOLI L，KOPP J，et al.The SWISS MODEL Work space：A web based environment for protein structure homology modeling［J］.Bioinformatics，2006，22（2），195-201.

［11］ SCHWEDE T，KOPP J，GVEX N，et al.SWISS-MODEL：an automated protein homology-modeling server［J］.Nucleic Acids Research，2003，31（13）：3381-3385.

［12］ GUEX N，PEITSCH M C.SWISS-MODEL and the Swiss-Pdb Viewer：an environment for comparative protein modelling［J］.Electrophoresis，1997，18（15）：2714-2723.

［13］ SONG B，WARD B B.Molecular characterzation of the assimilatory nitrate reductase gene and its express in the marine green alga Dunaliella tertiolecta（Chlorophyceae）［J］.Journal of Phycology，2004，40（4），721-731.

［14］ KUMAR S，NEI M，DVDLEY J，et al.A biologistcentric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences［J］.Briefings in Bioinformatics，2008，9（4）：299-306.

［15］ EICKEN H，BOCK C，WITTIG R，et al.Magnetic resonance imagine of sea-ice pore fluids：methods and thermal evolution of pore microstructure［J］.Cold Regions Science and Technology，2000，31（3）：207-225.

［16］ LIVAK K J，SCHMITTIGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C［J］）method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［17］ LIU H H，LIU J，F(xiàn)AN S L，et al.Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum ［J］.Journal of Experimental Botany，2008，59（3）：633-644.

［18］ CHUNG E，CHO C H，YUN B M，et al.Molecular cloning and characterization of the soybean DEAD-box RNA helicase gene induced by low temperature and high salinity stress［J］.Gene，2009，443（1-2）：91-99.

［19］ LI D，LIU H，ZHANG H，et al.OsBIRH1 a DEAD-box RNA helicase with functions in modulating defence responses against pathogen infection and oxidative stress［J］.Journal of Experimental Botany，2008，59（8）：2133-2146.

［20］ GONG Z，DONG C H，LEE H，et al.A DEAD-box RNA helicase is essential for mRNA export and important for development and stress responses in Arabidopsis［J］.The Plant Cell，2005，17（1）：256-267.

［21］ ZHU J，DONG C H，ZHU J K.Interplay between cold-responsive gene regulation，metabolism and RNA processing during plant cold acclimation.Curr.Opin［J］.Current Opinion in Plant Biology，2007，10（3）：290-295.