陳澤 馬建兵 黃星榞 賈棋 徐春華張慧東 陸穎?

1 引 言

解旋酶是一類在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的分子馬達(dá)蛋白,種類繁多.不同解旋酶具有不同的功能及特性,在脫氧核糖核酸(DNA)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、重組以及端粒穩(wěn)定等諸多方面都發(fā)揮著不可忽視的作用[1?3].人體內(nèi)的諸多過(guò)程都涉及數(shù)量龐大的生物分子,常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法僅能檢測(cè)初始態(tài)和終態(tài)的平均效應(yīng)結(jié)果,不僅僅忽略了更為關(guān)鍵的中間過(guò)程,也缺少對(duì)于生物個(gè)體差異性和多樣性的分析.單分子技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的一種先進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù),能夠用于針對(duì)單個(gè)生物分子的研究,以得到常規(guī)技術(shù)無(wú)法得到的諸多重要信息[4].近些年來(lái),單分子技術(shù)越來(lái)越多地運(yùn)用到解旋酶的相關(guān)研究中,使得科研人員對(duì)于解旋酶的功能和機(jī)制的認(rèn)知越來(lái)越清晰.解旋酶在解旋過(guò)程中進(jìn)行的換鏈現(xiàn)象是其功能中非常重要的一項(xiàng),這種換鏈現(xiàn)象對(duì)于解旋酶而言,能夠在其遭遇各類DNA損傷時(shí),避免發(fā)生停滯而導(dǎo)致復(fù)制體崩解,乃至細(xì)胞死亡;同時(shí),能夠以此方式消除結(jié)合在DNA上的內(nèi)源性中間產(chǎn)物及單鏈DNA結(jié)合蛋白,確保解旋過(guò)程的順利進(jìn)行[5];最后,換鏈現(xiàn)象還能夠直接參與到同源重組的過(guò)程中,并發(fā)揮作用.因此,深入研究解旋酶進(jìn)行換鏈的機(jī)制具有重要意義和價(jià)值.

目前運(yùn)用單分子技術(shù)的相關(guān)研究表明,諸如Pif1[6],RecQ[7],BLM[5]及UvrD[8]等非環(huán)狀解旋酶在解旋過(guò)程中是存在換鏈現(xiàn)象的.研究Pif1換鏈過(guò)程的文獻(xiàn)[6]提及,其發(fā)生換鏈的原因在于Pif1可能與3′-尾鏈之間存在一個(gè)相互作用,這種相互作用會(huì)將Pif1從5′-鏈拉至3′-鏈, 并在此鏈上繼續(xù)行走,而解開部分的單鏈DNA退火重新形成雙鏈DNA.對(duì)于六聚體解旋酶而言,因其6個(gè)子單位形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),人們總是直觀地認(rèn)為這種結(jié)構(gòu)會(huì)穩(wěn)定地存在于單鏈DNA上而無(wú)法自由脫落下來(lái).基于這種猜想,科研人員認(rèn)為六聚體解旋酶是通過(guò)從單鏈DNA的端口處直接穿入的方式進(jìn)行加載,并進(jìn)一步結(jié)合在單鏈DNA上進(jìn)行行走.如果是這種加載方式,六聚體解旋酶無(wú)疑是無(wú)法發(fā)生換鏈過(guò)程的.然而,不論是磁鑷(magnetic tweezers,MT)實(shí)驗(yàn)還是光鑷實(shí)驗(yàn)[9,10],單鏈DNA的兩端均被固定,不存在所謂的自由端口.而在溶液中已形成六聚體的解旋酶依舊能夠直接加載在單鏈DNA上進(jìn)行行走和解旋,說(shuō)明這種加載方式并不準(zhǔn)確.因此,本文以此作為切入點(diǎn),以T7解旋酶為研究對(duì)象,力求揭示六聚體解旋酶是否能夠進(jìn)行換鏈的問(wèn)題.

本文主要采用的單分子技術(shù)為單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(single-molecule fl uorescence resonance energy transfer,smFRET)和MT.熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是一種通過(guò)兩個(gè)熒光基團(tuán)之間無(wú)輻射的偶極耦合的相互作用來(lái)進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移的方式.能量通常由供體熒光基團(tuán)(短波長(zhǎng))傳遞給受體熒光基團(tuán)(長(zhǎng)波長(zhǎng)).本文用于smFRET的儀器裝置為常規(guī)的全內(nèi)反射顯微系統(tǒng),為消除其余因素對(duì)于信號(hào)的影響,生物分子被固定在玻片表面.MT技術(shù)是將單個(gè)生物分子通過(guò)相應(yīng)修飾后使其一端連接在玻片表面,另一端連接在超順磁性小球表面.磁球位于外磁場(chǎng)中而受到恒定磁力的作用,通過(guò)改變磁場(chǎng)強(qiáng)度(平移或者旋轉(zhuǎn)裝置上磁鐵)可以實(shí)現(xiàn)拉伸或旋轉(zhuǎn)磁球等操縱,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于單個(gè)生物分子的力學(xué)操縱.本文采用常規(guī)的縱向MT開展研究.

通過(guò)運(yùn)用smFRET和MT技術(shù),本文能夠?qū)崟r(shí)地觀測(cè)DNA底物被T7解旋酶解開的動(dòng)態(tài)過(guò)程,進(jìn)而能夠得到解旋過(guò)程的具體信息,便于分析解旋酶的解旋機(jī)制.運(yùn)用smFRET技術(shù)研究解旋反應(yīng)能夠觀測(cè)的解旋長(zhǎng)度較短(<10 bp),但是其精度非常高,對(duì)于精確研究較小尺度內(nèi)的解旋過(guò)程和機(jī)制有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì).本文研究的主要問(wèn)題是六聚體解旋酶的換鏈現(xiàn)象,因此采用smFRET技術(shù)能夠更精確地觀測(cè)此過(guò)程;運(yùn)用MT技術(shù)研究解旋反應(yīng)能夠觀測(cè)的解旋長(zhǎng)度較大,但是其精度比不上smFRET技術(shù).本文運(yùn)用MT技術(shù)在大尺度上觀測(cè)這種換鏈現(xiàn)象是否依舊存在,并進(jìn)一步分析施加力的作用是否會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響.因此,本文同時(shí)采用了smFRET和MT兩種技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以達(dá)到研究目的.

解旋實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變熒光標(biāo)記DNA的方法以及改變GC含量和脫氧胸苷三磷酸(dTTP)濃度等實(shí)驗(yàn)條件,深入地探究了T7解旋酶是否如單體解旋酶一樣存在換鏈過(guò)程.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明T7解旋酶的解旋工作需要3′-尾鏈的參與,且DNA序列中GC含量的提高能夠?qū)е缕涓装l(fā)生回退;在所有的回退現(xiàn)象中存在著一種緩慢回退的現(xiàn)象,我們推測(cè)該現(xiàn)象為六聚體解旋酶的換鏈過(guò)程,并提出其模型.

2 實(shí)驗(yàn)方法和材料

2.1 玻片的清洗與修飾

先后用丙酮、甲醇、濃硫酸和過(guò)氧化氫混合液(體積比7:3)及乙醇鈉對(duì)FRET實(shí)驗(yàn)用蓋玻片和載玻片進(jìn)行徹底清洗,蓋玻片需要進(jìn)一步進(jìn)行硅烷化和聚乙二醇(PEG,購(gòu)于Laysan Bio,Inc.公司)修飾,具體方法參照文獻(xiàn)[11];MT實(shí)驗(yàn)用蓋玻片和載玻片清洗方法同于FRET實(shí)驗(yàn)用玻片,后期需要進(jìn)一步用Sigmacote(購(gòu)于Sigma-Aldrich公司)修飾,具體方法參照文獻(xiàn)[12].

2.2 DNA設(shè)計(jì)

單分子FRET實(shí)驗(yàn)用DNA共5種:一種是不存在3′-尾鏈的雙鏈DNA底物,于雙鏈岔口標(biāo)記Cy3和Cy5熒光分子,序列中GC含量設(shè)計(jì)為70%;一種是3′-尾鏈為單鏈結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA底物,標(biāo)記方法與前相同,序列中GC含量設(shè)計(jì)為70%;另外3種3′-尾鏈均為雙鏈但留有1 nt單鏈結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA底物,Cy3標(biāo)記在雙鏈上第8位,Cy5標(biāo)記在岔口,序列中GC含量分別設(shè)計(jì)為50%,70%和100%.所有DNA底物均通過(guò)在一條鏈尾端修飾生物素連接在玻片上.DNA底物均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司,詳細(xì)制備方法見文獻(xiàn)[13].MT實(shí)驗(yàn)用DNA是輪廓長(zhǎng)度為0.5μm帶有270 bp發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA,詳細(xì)制備方法見文獻(xiàn)[6].

2.3 蛋白質(zhì)及緩沖液

T7 gp4解旋酶蛋白由陸軍軍醫(yī)大學(xué)毒理學(xué)研究所張慧東課題組純化完成,具體方法見文獻(xiàn)[14,15].蛋白純化完成后,在盛有儲(chǔ)存液(50 mM(1 M=1 mol/L)K-phosphate,0.1 mM乙二胺四乙酸(EDTA),0.1 mM二硫蘇糖醇(DTT)及50%甘油)的燒杯中進(jìn)行透析,并于?30?C密封保存.實(shí)驗(yàn)所用的緩沖液包括:T50緩沖液(50 mM NaCl及20 mM Tris-HCl,pH值為8.0),反應(yīng)緩沖液(10 mM MgCl2,50 mM NaCl,5 mM DTT及20 mM Tris-HCl,p H值為8.0)以及磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)(20 mM Na2HPO4,150 mM NaCl,p H值為8.0).緩沖液配置后需要進(jìn)行高溫消毒,再經(jīng)孔徑為0.2μm的過(guò)濾器過(guò)濾,最后于?20?C密封保存.

2.4 解旋實(shí)驗(yàn)方法

MT實(shí)驗(yàn)中,首先取磁球原液10μL,加入20μL PBS緩沖液并用移液槍吹打清洗,隨后用磁鐵吸引磁球去除上清液,反復(fù)操作3次,最后稀釋至20μL.隨后,取1μL 100 p M的DNA底物(帶有270 bp發(fā)卡結(jié)構(gòu))與磁球稀釋液充分混勻1 min.將上述混合液泵入實(shí)驗(yàn)槽中,孵育10 min使得磁球充分連接在玻片表面,并沖走多余未連接磁球.具體的磁球尺寸、修飾方法及操作方法見文獻(xiàn)[6].通過(guò)檢測(cè)連接磁球上的DNA底物為單根且較為穩(wěn)定后,開始進(jìn)行下一步解旋實(shí)驗(yàn).首先將高濃度gp4單體解旋酶與2 mM d TTP混勻孵育10 min,使其充分形成六聚體結(jié)構(gòu).隨后在上述混合液中加入T50緩沖液及DTT,通過(guò)恒流泵泵入槽中,孵育10 min使得T7解旋酶充分結(jié)合在DNA底物上,且因沒有鎂離子而無(wú)法啟動(dòng)解旋反應(yīng).當(dāng)孵育完成后,泵入T50緩沖液充分沖掉槽中多余的解旋酶,確保后續(xù)為單個(gè)解旋酶進(jìn)行反應(yīng).最后,泵入含鎂離子的反應(yīng)緩沖液,實(shí)驗(yàn)濃度d TTP及DTT啟動(dòng)解旋反應(yīng),收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);smFRET實(shí)驗(yàn)中,首先取1μL鏈霉親和素原液(1 mg/mL),用T50緩沖液稀釋至100μL,充分混勻后加入實(shí)驗(yàn)槽中孵育5 min.隨后沖走多余鏈霉親和素,加入約100 pM帶熒光標(biāo)記的DNA底物孵育5 min.隨后沖走多余DNA,觀察DNA連接情況良好后進(jìn)行下一步解旋實(shí)驗(yàn),具體的原料來(lái)源、修飾方法及操作方法見文獻(xiàn)[13].后續(xù)解旋實(shí)驗(yàn)的步驟與MT實(shí)驗(yàn)的步驟保持一致,只是需要在啟動(dòng)解旋反應(yīng)并收集數(shù)據(jù)的泵入反應(yīng)液中加入抗熒光淬滅體系(0.8%D-葡萄糖,1 mg/mL葡糖氧化酶,0.4 mg/mL過(guò)氧化氫酶和1 mM水溶性維生素E).

3 結(jié)果與討論

3.1 T 7解旋酶的解旋反應(yīng)

T7解旋酶是5′-3′方向行走的解旋酶,因此正常的解旋反應(yīng)需要足夠長(zhǎng)的5′-尾鏈用于解旋酶結(jié)合.有研究表明,T7解旋酶的解旋反應(yīng)還需要3′-尾鏈的存在,認(rèn)為其與3′-尾鏈之間存在著某種相互作用[16,17],并發(fā)現(xiàn)3′-尾鏈的單鏈部分長(zhǎng)度必須大于7 nt時(shí),T7解旋酶才能夠正常進(jìn)行解旋反應(yīng).那么T7解旋酶是怎樣與3′-尾鏈上DNA進(jìn)行相互作用的呢?為此,本文設(shè)計(jì)了一組DNA底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),其5′-尾鏈均有30 nt的單鏈以供解旋酶結(jié)合,3′-尾鏈分別設(shè)計(jì)為不存在尾鏈、存在30 nt單鏈的尾鏈及存在29 bp雙鏈及1 nt單鏈的尾鏈結(jié)構(gòu),如圖1(a),(c),(e)所示.

FRET解旋實(shí)驗(yàn)使用的DNA底物均為帶有熒光標(biāo)記的雙鏈DNA,Cy3標(biāo)記在3′-鏈,Cy5標(biāo)記在解旋酶結(jié)合的5′-鏈上.實(shí)驗(yàn)是通過(guò)532 nm激光激發(fā)Cy3發(fā)出熒光,并通過(guò)能量轉(zhuǎn)移而使得Cy5同樣發(fā)出熒光.因此,隨著解旋酶解開雙鏈DNA,Cy3和Cy5之間距離增大,能量轉(zhuǎn)移效率(FRET值)隨之降低.當(dāng)解旋酶完全解開雙鏈DNA,即解旋到頭時(shí),Cy3標(biāo)記的3′-鏈會(huì)因?yàn)殡p鏈部分完全打開而脫落,導(dǎo)致Cy3熒光強(qiáng)度和Cy5熒光強(qiáng)度均迅速降低至0,由此現(xiàn)象來(lái)判斷解旋酶是否解旋到頭[18].

通過(guò)解旋實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)T7解旋酶在無(wú)3′-尾鏈結(jié)構(gòu)參與的條件下無(wú)法進(jìn)行解旋反應(yīng),如圖1(b)所示,Cy3和Cy5之間距離一直保持不變,FRET值維持為1.說(shuō)明以往研究中提及的解旋酶與3′-尾鏈之間存在相互作用的結(jié)論是成立的.當(dāng)缺乏這種相互作用時(shí),解旋酶就無(wú)法進(jìn)行解旋[16,17].3′-尾鏈設(shè)計(jì)為單鏈DNA和雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(d)和圖1(f)所示,當(dāng)3′-尾鏈為單鏈DNA時(shí),因Cy3和Cy5距離很近,初始FRET值為1.隨著解旋反應(yīng)的進(jìn)行,Cy3和Cy5的距離逐漸變大而導(dǎo)致Cy3熒光強(qiáng)度不斷增加,Cy5熒光強(qiáng)度不斷降低,FRET值隨之不斷降低,最終完全解開雙鏈;當(dāng)3′-尾鏈為雙鏈DNA時(shí),初始FRET值約為0.9,隨著解旋反應(yīng)的進(jìn)行與前者有著相似的現(xiàn)象.

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明3′-尾鏈的存在對(duì)于T7解旋酶進(jìn)行解旋反應(yīng)尤為重要,即此解旋酶行使其解旋功能需要DNA底物為叉形結(jié)構(gòu).由于3′-尾鏈為單鏈或雙鏈結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并無(wú)本質(zhì)不同,本文推測(cè)T7解旋酶或與3′-尾鏈上磷酸根結(jié)構(gòu)域存在著某種相互作用.

圖1 不同3′-尾鏈結(jié)構(gòu)DNA底物的sm FRET解旋現(xiàn)象 (a)不存在3′-尾鏈結(jié)構(gòu)時(shí)DNA底物的實(shí)驗(yàn)示意圖;(b)對(duì)應(yīng)(a)圖DNA底物的T 7解旋酶解旋數(shù)據(jù);(c)3′-尾鏈為單鏈DNA結(jié)構(gòu)時(shí)DNA底物的實(shí)驗(yàn)示意圖;(d)對(duì)應(yīng)(c)圖DNA底物的T7解旋酶解旋數(shù)據(jù);(e)3′-尾鏈為雙鏈DNA結(jié)構(gòu)時(shí)DNA底物的實(shí)驗(yàn)示意圖;(f)對(duì)應(yīng)(e)圖DNA底物的T 7解旋酶解旋數(shù)據(jù)Fig.1.Observation of DNA with diff erent 3′-tail structures unwinding with smFRET assay:Schematic diagram of the smFRET experiment in DNA substrate with diff erent 3′-tail structures(a),(c)and(e);smFRET-time traces showing from three diff erent structures of DNA,respectively(b),(d)and(f).

3.2 序列中GC含量對(duì)T 7解旋酶解旋反應(yīng)的影響

已有研究表明,解旋部分的DNA序列中GC含量越高,T7解旋酶的解旋速率越慢[18,19].然而,人們并沒有關(guān)注到這種GC含量的提高是否會(huì)影響其解旋長(zhǎng)度.常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法受限于技術(shù)并不能解決此問(wèn)題,而以往FRET實(shí)驗(yàn)所采用的熒光標(biāo)記手段,當(dāng)解旋長(zhǎng)度很短時(shí)并不能檢測(cè)到相應(yīng)FRET值的變化.基于此,本文在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)序列中包含50%,70%和100%GC含量的3種DNA底物,采用上述改良的熒光標(biāo)記方法如圖1(c)所示,運(yùn)用sm-FRET技術(shù)進(jìn)行T7解旋酶的解旋實(shí)驗(yàn),解旋數(shù)據(jù)和解旋是否到頭的判定方法與圖1標(biāo)準(zhǔn)保持一致.

本文在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)用DNA底物時(shí)參考最近運(yùn)用smFRET技術(shù)研究T7解旋酶的文獻(xiàn)[18].如文獻(xiàn)[18]中所描述的,當(dāng)DNA序列中GC含量為35%時(shí),解旋速率為8 bp/s;而GC含量為80%時(shí),其解旋速率僅為4 bp/s,這也是其使用的最大GC含量的DNA底物.由文獻(xiàn)[18]可知,提高GC含量能夠更加明顯地觀測(cè)解旋酶進(jìn)行解旋的中間過(guò)程.因此,本文在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí),為降低實(shí)驗(yàn)中的解旋速率以便更加精確地評(píng)估其解旋過(guò)程,同時(shí)為設(shè)計(jì)一組GC含量變化梯度比較其解旋長(zhǎng)度的變化情況,決定將實(shí)驗(yàn)中DNA序列的GC含量確定為50%,70%和100%.

另一方面,文獻(xiàn)[18]中提及降低d TTP濃度能夠降低解旋速率,本文實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變d TTP濃度梯度,發(fā)現(xiàn)100μM d TTP濃度條件下能夠明顯降低解旋酶的解旋速率,便于觀測(cè)解旋中間過(guò)程,且不至于明顯影響解旋酶的解旋比例.因此,本文解旋實(shí)驗(yàn)均在100μM d TTP濃度條件下進(jìn)行.

由圖2結(jié)果可知,當(dāng)序列中GC含量為50%時(shí),T7解旋酶解旋到頭的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比例約為78%,解旋中途回退的比例約為22%;當(dāng)序列中GC含量為70%時(shí),T7解旋酶解旋到頭的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比例約為61%,解旋中途回退的比例約為39%;當(dāng)序列中GC含量為100%時(shí),T7解旋酶解旋到頭的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比例僅約為21%,解旋中途回退的比例約為79%.由此可知,GC含量從50%提高至100%時(shí),會(huì)明顯提高解旋酶在解旋過(guò)程中發(fā)生回退的概率,導(dǎo)致其解旋長(zhǎng)度降低.

在解旋過(guò)程中,這種回退現(xiàn)象發(fā)生的前提是解旋酶無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行解旋反應(yīng)而發(fā)生暫?；蛲?然而,這種暫?；蛲F(xiàn)象并不能穩(wěn)定維持,解旋酶會(huì)進(jìn)一步失去與單鏈DNA之間的相互作用.此時(shí),解旋酶或直接從單鏈DNA上脫落下來(lái),解開部分單鏈自由退火形成雙鏈;或解旋酶雖然缺失與單鏈DNA的相互作用,但并未脫落,解開部分單鏈仍然自由退火而形成雙鏈,解旋酶滑退回初始位置.從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)上看,當(dāng)DNA序列為全GC時(shí),T7解旋酶大多數(shù)都無(wú)法解旋到頭.

因此,我們認(rèn)為DNA序列中GC含量高,不僅會(huì)影響解旋酶的解旋速率,還會(huì)導(dǎo)致其更易發(fā)生暫停或停滯,進(jìn)而發(fā)生回退現(xiàn)象,使得解旋長(zhǎng)度明顯降低.分析其原因,可能是解旋酶在解旋過(guò)程中不僅受到當(dāng)前解旋位置堿基對(duì)之間氫鍵作用力的限制,后續(xù)DNA序列的穩(wěn)定程度也會(huì)對(duì)其解旋過(guò)程造成影響.當(dāng)DNA序列中GC含量非常高,乃至為GC含量為100%時(shí),這種穩(wěn)定程度可能會(huì)使得解旋酶難以克服而無(wú)法繼續(xù)往前解旋.

3.3 T 7解旋酶在解旋過(guò)程中的回退現(xiàn)象

3.2 節(jié)提及當(dāng)GC含量為100%時(shí),T7解旋酶在解旋過(guò)程中大多數(shù)無(wú)法解旋到頭而在中途發(fā)生回退.通過(guò)進(jìn)一步分析數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的回退現(xiàn)象是瞬時(shí)回去的過(guò)程,如圖3(a)所示.但是,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中還存在一種緩慢回退的現(xiàn)象,如圖3(b)所示.這里對(duì)于瞬時(shí)回退和緩慢回退兩種現(xiàn)象的界定在于前者在回到初始位置的過(guò)程中并不存在停頓或過(guò)程,分析僅為一步完成;而后者在回到初始位置的過(guò)程中存在諸多的停頓或過(guò)程,從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)上來(lái)看,可以觀測(cè)到許多的數(shù)據(jù)點(diǎn)存在于這一回退過(guò)程中,分析為多步完成.因此,瞬時(shí)回退現(xiàn)象并不代表其是一瞬間回到初始位置,相對(duì)于緩慢回退來(lái)講,這里的瞬時(shí)指的是回退過(guò)程中不存在中間步驟,而緩慢指的是回退過(guò)程中存在諸多中間步驟.

圖2 三種不同GC含量DNA底物的T 7 gp4解旋現(xiàn)象 (a)DNA底物GC含量為50%;(b)DNA底物GC含量為70%;(c)DNA底物GC含量為100%Fig.2.Analysis of unwinding processivity of T7 gp4 helicase in DNA substrate with diff erent GC contents:(a)Helicase in DNA substrate with 50%GC content;(b)helicase in DNA substrate with 70%GC content;(c)helicase in DNA substrate with 100%GC content.

通過(guò)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可知,所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中存在瞬時(shí)回退現(xiàn)象的比例約為81%,而存在緩慢回退現(xiàn)象的比例約為19%.對(duì)于前者而言,當(dāng)T7解旋酶無(wú)法繼續(xù)解旋而發(fā)生暫?；蛲r(shí),因無(wú)法穩(wěn)定維持此狀態(tài),解旋酶或從單鏈DNA上脫落而解開部分單鏈因退火壓力而自由形成雙鏈;或雖失去與單鏈DNA的相互作用但繼續(xù)留在5′-鏈上,解開部分單鏈自由退火而形成雙鏈,解旋酶滑退回初始位置.這兩個(gè)過(guò)程都非?？於鴮?dǎo)致觀察幾乎是瞬時(shí)的,不存在中間步驟.同時(shí),因這兩個(gè)過(guò)程僅僅是T7解旋酶的狀態(tài)存在區(qū)別,DNA底物的狀態(tài)是一致的,而FRET實(shí)驗(yàn)的觀測(cè)對(duì)象是熒光標(biāo)記DNA,所以無(wú)法區(qū)分這兩種情況,均算入瞬時(shí)回退現(xiàn)象中.在圖3(a)的時(shí)間曲線中,隨著T7解旋酶解開雙鏈,FRET值逐漸降低至約0.1.此時(shí),解旋酶因無(wú)法繼續(xù)解旋而在5′-鏈上滑退回初始位置或直接從DNA底物上脫落下來(lái),解開雙鏈DNA迅速退火重新形成雙鏈DNA而導(dǎo)致FRET值恢復(fù)初始值.圖3(a)所示實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象在文獻(xiàn)[9]中也有所提及.而對(duì)于少數(shù)情況下解旋酶發(fā)生緩慢回退的現(xiàn)象,以往并沒有研究發(fā)現(xiàn).

通過(guò)分析相關(guān)文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)早期研究中,如果改變DNA底物迫使T7解旋酶必須由3′到5′方向進(jìn)行解旋時(shí),完全無(wú)法觀察到解旋現(xiàn)象[20?23].因此,T7解旋酶僅能從5′到3′方向進(jìn)行單向的行走和解旋,而完全無(wú)法從3′到5′方向進(jìn)行行走和解旋,將這種現(xiàn)象稱為T7解旋酶的極性,也稱為單向性.此外,這種極性不僅僅存在于T7解旋酶,經(jīng)過(guò)研究諸多解旋酶都被證實(shí)存在極性,僅能沿著單向進(jìn)行行走和解旋.因此,反觀本文的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),如果這種緩慢回退的現(xiàn)象發(fā)生在5′-鏈,表明T7解旋酶是從3′到5′方向進(jìn)行行走,這種現(xiàn)象在以往的研究中完全未被觀察到,且不符合公認(rèn)的解旋酶具有極性的結(jié)論.因此,本文認(rèn)為這種緩慢回退的現(xiàn)象是發(fā)生在3′-鏈上,而不可能發(fā)生在5′-鏈上. 換而言之,這一現(xiàn)象預(yù)示著T7解旋酶換到了對(duì)面的3′-鏈上,即這個(gè)六聚體解旋酶在解旋過(guò)程中發(fā)生了換鏈現(xiàn)象.

圖3 T 7解旋酶的兩種回退現(xiàn)象(100%GC) (a)瞬時(shí)回退;(b)緩慢回退Fig.3.Two diff erent backward movements of T 7 helicase(100%GC):(a)Rapid rewinding process;(b)slow rewinding process.

3.4 運(yùn)用M T技術(shù)研究T 7解旋酶的緩慢回退現(xiàn)象

基于上述結(jié)果和猜想,進(jìn)一步設(shè)計(jì)MT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究,DNA連接方式如圖4(a)所示.d TTP濃度及序列中GC含量均保持與FRET實(shí)驗(yàn)一致,實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[18]中的步驟,確保均由單個(gè)解旋酶進(jìn)行解旋反應(yīng).MT實(shí)驗(yàn)中使用的DNA底物解旋部分發(fā)卡結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度為270 bp,隨著解旋酶解旋反應(yīng)的進(jìn)行,發(fā)卡結(jié)構(gòu)逐漸被打開,檢測(cè)到磁球高度發(fā)生相應(yīng)變化,由此來(lái)判斷是否為解旋數(shù)據(jù).通過(guò)計(jì)算解旋酶解開的發(fā)卡結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度是否到達(dá)270 bp,來(lái)判斷解旋酶是否完成解旋反應(yīng),即解旋到頭.

如圖4(b)所示,當(dāng)T7解旋酶解旋到頭,即完全解開發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA時(shí),其會(huì)沿著3′-鏈繼續(xù)行走回到初始位置.從數(shù)據(jù)上來(lái)看,這種行走并不是瞬時(shí)過(guò)程,而是有一定中間步驟的過(guò)程.其速度大于在5′-鏈上進(jìn)行解旋的速度,可能是由于DNA雙鏈退火壓力加快了這一行走速度.當(dāng)T7解旋酶并沒有完全打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA而停止解旋時(shí),從數(shù)據(jù)上看多數(shù)情況下會(huì)瞬時(shí)回到初始位置,而少數(shù)情況下是一種緩慢回退的過(guò)程,如圖4(c)和圖4(d)所示.運(yùn)用MT技術(shù)進(jìn)行解旋實(shí)驗(yàn)得到的未解旋到頭的數(shù)據(jù)中,瞬時(shí)回退現(xiàn)象所占比例約為76%,緩慢回退現(xiàn)象所占比例約為24%,基本與FRET實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果保持一致.這種未解旋到頭且發(fā)生緩慢回退的現(xiàn)象區(qū)別于圖4(b)中的現(xiàn)象,其并不是因?yàn)榻庑筋^而直接移動(dòng)到3′-鏈上沿著5′到3′方向行走.如果此時(shí)解旋酶依舊位于5′-鏈上,這種緩慢回退的行走方式并不符合T7解旋酶僅能由5′到3′單向移動(dòng)的單向性或極性[16,20?25].另一方面,不論是本文實(shí)驗(yàn)還是已發(fā)表文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)[9,10],已形成環(huán)狀六聚體的T7解旋酶都能夠直接結(jié)合在沒有5′和3′端口的單鏈DNA上開始行走和解旋,說(shuō)明其也能以相同的方式從此單鏈DNA上脫落下來(lái).同時(shí),MT實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)到的這種緩慢回退的現(xiàn)象與FRET實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)到的現(xiàn)象基本保持一致,相互印證.由此可知,這種緩慢回退的現(xiàn)象是因?yàn)門7解旋酶在解旋過(guò)程中發(fā)生了換鏈現(xiàn)象,且這種換鏈現(xiàn)象與DNA底物以及施加其上的力沒有關(guān)系,它是T7解旋酶的一種本征性質(zhì).

圖4 MT實(shí)驗(yàn)研究T 7解旋酶的緩慢回退現(xiàn)象 (a)單分子MT實(shí)驗(yàn)示意圖;(b)T 7解旋酶在解旋到頭時(shí),緩慢行走的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象;(c)T7解旋酶在未解旋到頭時(shí),瞬時(shí)回退的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象;(d)T7解旋酶在未解旋到頭時(shí),緩慢回退的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象Fig.4.The slow rewinding process of T 7 helicase by magnetic tweezers:(a)Schematic diagram of the magnetic tweezers assay;(b)slow translocation phenomenon of T 7 helicase after unwinding the whole DNA hairpin;(c)rapid rewinding process of T 7 helicase during unwinding;(d)slow rewinding process of T 7 helicase during unwinding.

3.5 T 7解旋酶換鏈機(jī)制的模型

研究表明,T7解旋酶可能是以一種開環(huán)的方式結(jié)合在單鏈DNA上,而非通常認(rèn)知的環(huán)狀解旋酶整體從5′端口進(jìn)入[26].基于此,T7解旋酶在解旋過(guò)程中也存在很大可能性發(fā)生開環(huán)而直接從單鏈DNA上解離而脫落下來(lái).從本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果和以往的文獻(xiàn)結(jié)論來(lái)看[16,17],T7解旋酶的解旋反應(yīng)必須有3′-尾鏈的參與,推測(cè)解旋酶在解旋過(guò)程中可能與3′-尾鏈之間存在某種相互作用.綜上所述,我們推測(cè)這種緩慢回退的現(xiàn)象是T7解旋酶在解旋過(guò)程中發(fā)生暫?；蛲r(shí),進(jìn)一步發(fā)生換鏈現(xiàn)象而轉(zhuǎn)移至3′-鏈上,沿著5′到3′的方向進(jìn)行行走回到初始位置.

基于此,本文進(jìn)一步提出了T7解旋酶進(jìn)行換鏈過(guò)程的模型,如圖5所示.圖5(a)表示的是T7解旋酶在解旋過(guò)程中發(fā)生暫?；蛲r(shí)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行解旋的狀態(tài).我們推測(cè)解旋酶與3′-尾鏈之間存在一個(gè)相互作用位點(diǎn),用紅色圓點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)示.當(dāng)T7解旋酶并不發(fā)生開環(huán)現(xiàn)象時(shí),它不能從單鏈DNA上脫落下來(lái)而繼續(xù)留在鏈上.此時(shí),解旋酶和單鏈DNA均處于完全自由狀態(tài),解開部分的單鏈DNA會(huì)自由退火形成雙鏈DNA,解旋酶會(huì)因受到退火壓力的作用而沿著5′-鏈快速滑退回到初始位置,如圖5(b)所示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中表現(xiàn)為瞬時(shí)回退現(xiàn)象;當(dāng)T7解旋酶在發(fā)生暫停或停滯的同時(shí)發(fā)生開環(huán)現(xiàn)象而完全從單鏈DNA上脫落下來(lái)時(shí),解開部分單鏈自由退火形成雙鏈DNA,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中同樣表現(xiàn)為瞬時(shí)回退現(xiàn)象,因采用的單分子技術(shù)檢測(cè)的對(duì)象為DNA底物而無(wú)法與圖5(b)中的情況進(jìn)行區(qū)分;當(dāng)這種開環(huán)現(xiàn)象的發(fā)生使得解旋酶從5′-鏈上脫落,但是仍然保持著與3′-鏈之間的相互作用時(shí),這種相互作用會(huì)使得解旋酶從5′-鏈上轉(zhuǎn)移到3′-鏈上,如圖5(c)所示;當(dāng)T7解旋酶重新穩(wěn)定結(jié)合在3′-鏈上時(shí),圖5(c)會(huì)過(guò)渡到圖5(d),解旋酶會(huì)進(jìn)一步在3′-鏈上沿著5′到3′方向開始行走過(guò)程.這一現(xiàn)象相對(duì)于單鏈DNA自由退火過(guò)程來(lái)說(shuō)是一個(gè)慢速過(guò)程,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中表現(xiàn)為緩慢回退現(xiàn)象.

因此,本文動(dòng)態(tài)觀測(cè)到六聚體解旋酶——T7解旋酶的換鏈過(guò)程,并提出其模型.相信此研究結(jié)果將推進(jìn)對(duì)于六聚體解旋酶功能和特性的理解,并進(jìn)一步完善對(duì)其分子機(jī)制的研究.

圖5 T 7解旋酶換鏈過(guò)程的模型 (a)T 7解旋酶在解旋過(guò)程中發(fā)生停滯的狀態(tài),紅色點(diǎn)表示與3′-尾鏈存在相互作用位點(diǎn);(b)T 7解旋酶發(fā)生瞬時(shí)回退或從單鏈DNA上脫落的狀態(tài);(c)T7解旋酶發(fā)生開環(huán),并借助相互作用重新結(jié)合到3′-鏈上;(d)T 7解旋酶穩(wěn)定地結(jié)合在3′-鏈,并緩慢進(jìn)行行走回到初始位置Fig.5.Model for the switching strand process of T 7 helicase:(a)T 7 helicase stop unwinding during its unwinding process,the red dot means the interaction site between T 7 helicase and 3′-tail;(b)the state that T 7 helicase instantaneously slipping back to initial position on the 5′-strand or dissociating from the 5′-strand;(c)the process that T 7 helicase open the ring-shaped structure and rebinding to the 3′-strand by the interaction with it;(d)the state that T 7 helicase slowly translocating to the initial position on the 3′-strand.

4 結(jié) 論

采用smFRET和MT技術(shù)對(duì)T7解旋酶在解旋過(guò)程中解旋和換鏈問(wèn)題進(jìn)行了研究.首先通過(guò)設(shè)計(jì)不同3′-尾鏈結(jié)構(gòu)的DNA底物驗(yàn)證了T7解旋酶進(jìn)行解旋反應(yīng)需要3′-尾鏈的參與,但是并不受其結(jié)構(gòu)為單鏈DNA或雙鏈DNA的影響.同時(shí),通過(guò)改變DNA序列中的GC含量,發(fā)現(xiàn)序列中GC含量的提高會(huì)導(dǎo)致T7解旋酶在解旋過(guò)程中更容易發(fā)生暫停或停滯,進(jìn)而從DNA底物上脫落或滑退回初始位置,降低其解旋長(zhǎng)度;通過(guò)分析解旋酶的回退現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)情況下為瞬時(shí)回退的過(guò)程,少數(shù)情況下為緩慢回退的過(guò)程;通過(guò)進(jìn)一步設(shè)計(jì)MT實(shí)驗(yàn),研究發(fā)現(xiàn)這種緩慢回退現(xiàn)象的存在,并由此推測(cè)出這種現(xiàn)象可能為T7解旋酶在解旋過(guò)程中發(fā)生的換鏈現(xiàn)象.最后,提出了T7解旋酶進(jìn)行換鏈過(guò)程的模型.

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