劉金河，張望明，晏文濤, 許鍵煒，葛章文

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004; 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3. 貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 貴陽 550002；4. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 貴陽 550001)

Bloom綜合征(Bloom syndrome，BS)是一種隱性的常染色體遺傳病，臨床主要特征是生長發(fā)育遲緩、面部有對(duì)光敏感的斑、免疫缺陷、易患多種癌癥及不孕不育[1]。BS主要是由細(xì)胞內(nèi)的Bloom解旋酶(Bloom helicase，BLM)突變導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致各種基因突變發(fā)生并誘發(fā)癌癥。BLM解旋酶能夠結(jié)合雙鏈DNA，利用ATP提供能量，由3′-5′解開雙鏈DNA[2]。因此，研究小分子藥物對(duì)BLM解旋酶功能的影響，尋找靶向特效抑制藥物，對(duì)治療此類癌癥具有重要意義。本研究中使用的BLM解旋酶為該酶的核心區(qū)域，氨基酸殘基序列區(qū)間為642-1290，簡稱BLM642-1290。

二氫楊梅素(dihydromyricetin，DMY)是一種黃酮類化合物(結(jié)構(gòu)見Fig 1)，主要存在于楊梅科、柳科、葡萄科、藤黃科等植物中，在藤茶屬植物中含量最高[3-4]。最近的研究表明，DMY具有廣泛的藥理活性，能夠通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡，多環(huán)節(jié)阻滯或延緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。在急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的損傷修復(fù)中，通過抑制TRAF3-p38信號(hào)通路來抑制AP的應(yīng)答[7]。在對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中，具有良好的修復(fù)作用[8]。在抑制肝臟的脂肪堆積，防止動(dòng)脈粥樣硬化方面，也具有明顯的療效[9]。在臨床上，能緩解地塞米松造成的肌肉萎縮[10], 能通過抑制semaphorin 4D來抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展[11]。另外，DMY的抗氧化作用也比較強(qiáng)，在抗炎、抗病原微生物、解酒護(hù)肝、調(diào)血脂等方面也有廣泛的應(yīng)用，具有較大的臨床應(yīng)用潛力[12]。

Fig 1 Chemical structure of DMY

目前對(duì)DMY的研究有很多，主要關(guān)注DMY的各種藥理作用，其中抗腫瘤方面著重在肝癌、乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤方面，而DMY對(duì)這些癌細(xì)胞及活體影響的分子機(jī)制的研究卻鮮見報(bào)道。本文采用圓二色譜(circular dichroism，CD)、自由磷檢測(cè)、紫外光譜、熒光偏振等技術(shù)和方法，研究DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)、生化活性、構(gòu)象的影響，探討DMY與BLM解旋酶相互作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑DMY(CAS27200-12-0,20 mg，上海源葉生物公司)；ATP酶活性檢測(cè)試劑盒(英國Innova Biosciences公司)；DNA底物雜交緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl，100 mmol·L-1NaCl，pH 7.9)；熒光偏振實(shí)驗(yàn)反應(yīng)緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl，25 mmol·L-1NaCl，3 mmol·L-1MgCl2和0.1 mmol·L-1DTT，pH 7.9)；ATP酶活性檢測(cè)緩沖液(0.1 mol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1ATP和4 nmol·L-1ssDNA，pH 7.9)；紫外光譜實(shí)驗(yàn)緩沖液C(20 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1NaCl，500 mmol·L-1咪唑，10%甘油，pH 7.9)；圓二色譜實(shí)驗(yàn)緩沖液為1×PBS。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器Ultrospec2100 Pro紫外分光光度計(jì)(美國GE公司)；NGCTM蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Beacon 2000熒光偏振儀(美國Panvera公司)；Milli-Q 超純水系統(tǒng)(美國Millipore Corp)；Bio-Logic電化學(xué)工作站(法國，Bio-Logic)。

1.3 DNA底物實(shí)驗(yàn)中的DNA底物由北京鼎國工程技術(shù)有限公司合成，其長度和序列見Tab 1。在40 μL DNA雜交緩沖液中，分別加入5 μL 100 μmol·L-1A1和A2單鏈DNA(ssDNA, A2)，90 ℃水浴3 min，室溫下自然冷卻復(fù)性，獲得雙鏈DNA(dsDNA，A1A2)，其作為熒光偏振實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)所需的雙鏈DNA底物。ATP酶活性測(cè)定中使用A1作為DNA底物。

1.4 BLM642-1290解旋酶的制備BLM解旋酶的重組大腸桿菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)奚緒光教授饋贈(zèng)。首先，將BLM642-1290解旋酶大腸桿菌的菌種在37 ℃復(fù)蘇，然后接種到5 L培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；在18 ℃條件下，擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌種中加入終濃度0.4 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)20 h; 4 ℃條件下，4 000 r·min-1離心15 min，收集管底部菌體，加入適量buffer A(20 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1NaCl,0.5 mmol·L-1咪唑, 10%甘油，pH 7.9)，高壓細(xì)胞破碎儀(英國Constant Systems公司)進(jìn)行細(xì)胞破碎(壓力為21 KPSI)，破碎1次，離心收集上清液; 在蛋白純化儀上，用鎳親合層析柱和Superdex-200(美國GE Healthcare公司)進(jìn)行分離和純化，獲得可用于開展生物學(xué)活性研究的BLM642-1290解旋酶(Fig 2)，考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)BLM642-1290蛋白純度(Fig 3)。本實(shí)驗(yàn)所需蛋白為Fig 3中1號(hào)泳道BLM，BCA法測(cè)定BLM642-1290解旋酶蛋白濃度為0.383 g·L-1。

Tab 1 Oligonucleotide sequences used in this study

Fig 2 Purification of BLM642-1290 by Ni affinity chromatography and molecular sieve chromatography

Fig 3 Determination of BLM helicase purity after molecular sieve chromatography

1.5 DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶構(gòu)象的影響緩沖液C中，終濃度為0.8 μmol·L-1BLM642-1290解旋酶與不同濃度梯度的DMY混合，25 ℃放置2 h后，于紫外分光光度計(jì)中掃描圖譜，速度為每次3 min，該反應(yīng)總體系為200 μL。另外，單獨(dú)掃描不同濃度梯度的DMY在緩沖液C中的紫外吸收光譜。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，掃描速度750 nm·min-1，掃描精度1 nm，掃描范圍200～400 nm。每個(gè)圖譜均為10～15個(gè)穩(wěn)定數(shù)據(jù)的平均值。

1.6 DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響在1×PBS緩沖液中，終濃度為0.8 μmol·L-1BLM642-1290解旋酶與不同濃度的DMY混合，總反應(yīng)體系為400 μL(1 mm光程比色皿)，先室溫下反應(yīng)30 min后，再利用stop-flow電化學(xué)工作站(法國BioLogic Science Instruments公司)進(jìn)行CD的檢測(cè)，掃描速度每次5 min，直到CD圖譜達(dá)到穩(wěn)定，連續(xù)測(cè)定20次穩(wěn)定后的CD圖譜數(shù)據(jù)，擬合獲得的20次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。色譜掃描區(qū)間為190～260 nm，掃描精度為1 nm，狹縫寬度為5 nm。

1.7 DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶DNA結(jié)合活性的影響在此實(shí)驗(yàn)中，采用2種方式來研究DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶DNA結(jié)合活性的影響[13]。第1種，BLM解旋酶與2 nmol·L-1的DNA(A2或A1A2)相互結(jié)合形成復(fù)合物，然后用不同濃度的DMY進(jìn)行滴定；第2種，在室溫下，不同濃度的DMY首先與BLM642-1290解旋酶反應(yīng)5 min，然后再加入到2 nmol·L-1DNA(ssDNA或dsDNA)的反應(yīng)緩沖液C中，熒光偏振儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)為10～15個(gè)穩(wěn)定偏振值平均之后的結(jié)果。

1.8 DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶DNA解鏈活性的影響此方法借鑒劉金河等[13]的實(shí)驗(yàn)方法，25 ℃條件下，DMY與BLM642-1290解旋酶混合5 min后，加入到含2 nmol·L-1A1A2反應(yīng)buffer中檢測(cè)偏振值的變化，當(dāng)偏振值達(dá)到穩(wěn)定后，再加入終濃度為0.2 mmol·L-1ATP，10 s檢測(cè)1次數(shù)據(jù)直到數(shù)據(jù)穩(wěn)定，取數(shù)據(jù)穩(wěn)定后的10～15個(gè)熒光偏振值數(shù)據(jù)求平均值，并進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。DNA解鏈的速率常數(shù)可根據(jù)方程(1)獲得：

At=A1exp(-kobst)

(1)

式中At是解鏈時(shí)間為t時(shí)的熒光偏振值，A1是解旋酶與dsDNA完全結(jié)合時(shí)的熒光偏振值。

1.9 DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶ATP酶活性的影響不同濃度DMY分別與終濃度10 nmol·L-1的BLM642-1290解旋酶混合5 min后，將該混合液與ATPase活性檢測(cè)液按照1∶1(V/V)的比例混合，并開始計(jì)時(shí)，在2.5、5、7.5、10、15、20、25、30 min時(shí)間點(diǎn)，分別取出反應(yīng)混合液200 μL，迅速加入到含50 μL Goldmix的EP管中，以終止ATP的水解反應(yīng)，2 min后，加入穩(wěn)定劑20 μL，平衡30 min，在650 nm波長下檢測(cè)其吸光度值[13]。如果酶活力定義為每分鐘催化1 mol底物水解所需的酶量(U·mL-1·min-1)，BLM642-1290解旋酶的酶活力可由方程式(2)計(jì)算得出。

(2)

式中，A是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出的Pi濃度(μmol·L-1)；B是反應(yīng)時(shí)間min；C是解旋酶的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 DMY能夠改變BLM642-1290解旋酶的空間結(jié)構(gòu)DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶的紫外吸收的影響如Fig 4所示，DMY在237 nm和330 nm處具有兩個(gè)紫外吸收峰(Fig 4A),而BLM642-1290解旋酶在237 nm和276 nm處具有兩個(gè)紫外吸收峰(Fig 4C)。當(dāng)DMY與BLM642-1290解旋酶相互作用后，紫外吸收峰位發(fā)生了偏移，從237 nm處的紅移到239 nm，峰型基本保持不變(Fig 4B)。進(jìn)一步分析可知，在237 nm處，BLM642-1290解旋酶與DMY相互作用后的紫外吸收值大于BLM642-1290解旋酶與DMY的紫外吸收值之和(1.25>0.49+0.25)(Fig 4C)，表明DMY與BLM642-1290解旋酶之間發(fā)生了相互作用，BLM642-1290解旋酶的構(gòu)象發(fā)生了變化。將[DMY]/[BLM642-1290]的比值與紫外吸收值進(jìn)行線性擬合，得一條直線(斜率k=0.0235)，可知BLM642-1290解旋酶與DMY有且僅有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(Fig 4D)。

2.2 DMY能部分解開BLM642-1290解旋酶二級(jí)結(jié)構(gòu)由Fig 5A可知，BLM642-1290解旋酶的α-螺旋結(jié)構(gòu)在不同濃度的DMY的作用下都有一定的結(jié)構(gòu)變化，208 nm和222 nm處的負(fù)峰也清晰可見，表明BLM642-1290解旋酶的結(jié)構(gòu)遭到一定程度的破壞，但是不能完全破壞其α-螺旋結(jié)構(gòu)，而是存在一個(gè)最適DMY濃度。由Fig 5B可知，在DMY濃度為0～25 μmol·L-1時(shí)，隨著DMY濃度的增加，α-螺旋在一定程度上逐漸解旋；當(dāng)DMY濃度大于25 μmol·L-1時(shí)，隨著DMY濃度的增加，α-螺旋又逐漸從松散狀態(tài)基本回到最初的狀態(tài)。

Fig 4 Ultraviolet(UV) absorption spectra of DMY interacted with BLM642-1290 helicase

Fig 5 Circular dichroism(CD) spectra of DMY interacted with BLM642-1290 helicase

2.3 DMY能夠抑制BLM642-1290解旋酶DNA結(jié)合活性DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶的DNA結(jié)合活性的影響見Fig 6。由圖可知，無論dsDNA(Fig 6A)還是ssDNA(Fig 6B)作為BLM642-1290解旋酶結(jié)合活性的底物，BLM642-1290與DNA相互結(jié)合而產(chǎn)生的熒光偏振值的增加量，都隨DMY濃度的增加而明顯減小(P<0.01)；另外，DMY單獨(dú)滴定dsDNA或者ssDNA的熒光偏振值無明顯變化，說明DMY與DNA并無相互作用(Fig 6C)。由此可以推斷，DMY與BLM642-1290解旋酶僅有的1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是在BLM642-1290解旋酶的DNA結(jié)合位點(diǎn)上，并且其與BLM642-1290解旋酶DNA結(jié)合位點(diǎn)的親和力大于DNA。

2.4 DMY能抑制BLM642-1290解旋酶DNA解鏈活性DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶的解鏈活性的影響見Fig 7。由Fig 7A可見，隨著反應(yīng)體系中DMY終濃度的逐漸增加(0～25.33 μmol·L-1)，因解鏈而降低的熒光偏振值(A1-A2)逐漸減小，表明BLM642-1290解旋酶的解鏈活性逐漸降低。由此可知，BLM642-1290解旋酶的解鏈活性被DMY抑制，但不能完全抑制其解鏈。根據(jù)公式(1)進(jìn)一步分析了DMY存在下BLM642-1290解旋酶的Kobs值的變化(Fig 7B)，隨著DMY濃度的增加，BLM642-1290解旋酶的Kobs值逐漸減小，表明DMY能夠抑制BLM642-1290解旋酶的解鏈活性。

2.5 DMY能明顯抑制BLM642-1290解旋酶的ATPase活性DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶的ATPase活性的影響見Fig 8。由Fig 8A可知，DMY能明顯抑制BLM642-1290解旋酶的ATPase活性(P<0.05)，且酶活力的高低與DMY的濃度呈負(fù)相關(guān),但不能完全抑制ATPase活性。由Fig 8B可知，在相同的酶濃度條件下，隨著時(shí)間的延長，BLM642-1290解旋酶的酶活力逐漸下降，表明BLM642-1290解旋酶的酶活力與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。通過米氏方程雙倒數(shù)作圖法進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算出酶反應(yīng)的Vmax、Km等常數(shù)，結(jié)果見Tab 2。隨著DMY濃度的增加，Vmax逐漸減小，而Km保持穩(wěn)定，且Kcat減小，證明DMY競爭性抑制BLM解旋酶的ATPase活性。

3 討論

BLM解旋酶是SF2超家族當(dāng)中的一員，由解旋酶結(jié)構(gòu)域(helicase)、RecQ保守的C末端結(jié)構(gòu)域(RecQ-Ct)和解螺旋酶RNA酶D碳末端(HRDC)結(jié)構(gòu)域組成[14]。Helicase結(jié)構(gòu)域具有該家族特有的保守基序(Ⅰ、Ⅱa、Ⅲ-Ⅵ)，結(jié)構(gòu)和功能研究顯示，motif Ⅰ和motif Ⅱ與NTP的結(jié)合有關(guān)。Motif Ⅳ和motif Ⅵ與ATP水解和核酸的結(jié)合有關(guān)，motif Q是SF2特有的保守序列，位于motif Ⅰ N末端前，其作用與ATP結(jié)合和水解有關(guān)。RecQ-Ct結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合活性及ATPase活性，但不能結(jié)合ATP。HRDC結(jié)構(gòu)域位于BLM解旋酶的C末端，能夠輔助性結(jié)合DNA，進(jìn)而調(diào)節(jié)其解鏈功能，也可增強(qiáng)和穩(wěn)定BLM解旋酶與DNA的結(jié)合，但不具有催化活性[13]。

Fig 6 Effects of DMY on DNA-binding activity of BLM642-1290 helicase

Tab 2 Effects of DMY on ATPase activity constants of BLM642-1290 helicase

Fig 7 Effects of DMY on DNA unwinding activity of BLM642-1290 helicase

Fig 8 Effects of DMY on ATPase activity of BLM642-1290 helicase

從CD實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，DMY對(duì)BLM解旋酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定影響，使得BLM解旋酶的結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生一定程度的松散，因α-螺旋結(jié)構(gòu)的微變化，使得Helicase結(jié)構(gòu)域內(nèi)負(fù)責(zé)與DNA相互結(jié)合的活性基團(tuán)的位置和距離發(fā)生微小變化，從而使得BLM與DNA的結(jié)合能力下降，而結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步看到BLM解旋酶與DMY的結(jié)合力大于與DNA的結(jié)合能力，因此，DMY搶奪BLM解旋酶的DNA結(jié)合位點(diǎn)。從紫外光譜實(shí)驗(yàn)和解鏈活性實(shí)驗(yàn)可以看出，DMY與BLM解旋酶的結(jié)合僅有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而在結(jié)果“2.3”的DMY對(duì)BLM642-1290解旋酶DNA結(jié)合活性的影響當(dāng)中可以看到，隨著DMY的濃度逐漸增加，BLM-dsDNA或BLM-ssDNA的偏振值增加量(A1-A0)逐漸降低，甚至為零，也就是說DMY能將DNA從BLM642-1290置換下來，并占據(jù)DNA的結(jié)合位點(diǎn)，另外，因ATPase活性的實(shí)現(xiàn)區(qū)域在BLM642-1290解旋酶的helicase結(jié)構(gòu)域中，為此我們大膽推斷，這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)很可能是在解旋酶結(jié)構(gòu)域上，且阻止了motif Ⅳ和motif Ⅵ與DNA的結(jié)合，這種結(jié)合與DNA形成了可逆的競爭性機(jī)制。BLM解旋酶是人體細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一類具有解開雙鏈DNA能力的活性蛋白質(zhì)，它參與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制、重組、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄等代謝過程，在維持染色體的穩(wěn)定性方面具有重要的作用。BLM解旋酶在多種腫瘤細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)升高，比如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、惡性淋巴瘤等[2,15]，抑制BLM解旋酶的活性或表達(dá)量，能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長。例如，甘草次酸下調(diào)BLM解旋酶的表達(dá)，并抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖[15]，敲減BLM基因后的PC3細(xì)胞增殖能力、侵襲能力和遷移能力明顯被絲裂霉素C抑制[16]。因此，尋找副作用小、價(jià)格便宜的小分子藥物也就顯得非常重要，這也為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新的思路。而提取DMY的植物在國內(nèi)分布廣泛、取材容易、成本低廉，成藥后價(jià)格不高，值得進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)研究驗(yàn)證了DMY確實(shí)可以抑制癌癥相關(guān)蛋白Bloom解旋酶的活性，也就在一定程度上說明DMY存在成為癌癥治療藥物的可能性，后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如何，有待進(jìn)一步的研究。

Fig 9 Domain of BLM helicase

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，衷心感謝各位同學(xué)和老師的支持和幫助)