李曉凱，劉 霞，常紅娟，王鳳茹

（河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

START 結(jié)構(gòu)域是一個(gè)長(zhǎng)度約為220 個(gè)氨基酸且可以結(jié)合并轉(zhuǎn)移脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。X 射線晶體學(xué)揭示了START 域的α/β 螺旋和反平行β 折疊結(jié)構(gòu)，內(nèi)含一個(gè)疏水腔，腔內(nèi)可容納單一配體分子，如固醇、磷脂、膽汁酸和神經(jīng)酰胺［1］。據(jù)報(bào)道，一些含START 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)還可與類胡蘿卜素和葉黃素結(jié)合［2］。已有研究表明START 結(jié)構(gòu)域在動(dòng)物中具有重要的生物學(xué)功能［3-14］，但植物中START 結(jié)構(gòu)域的功能及作用機(jī)制尚不明確。擬南芥中，START結(jié)構(gòu)域家族可分為僅含START 結(jié)構(gòu)域和多結(jié)構(gòu)域家族兩類，分別由9 個(gè)和26 個(gè)成員組成。根據(jù)結(jié)構(gòu)域組成的不同，可把35 個(gè)成員分為5 個(gè)亞家族，分別為僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族、START-DUF1336 結(jié)構(gòu)域亞家族、PH-START-DUF1336 結(jié)構(gòu)域亞家族、HD-ZIP-START 結(jié)構(gòu)域亞家族、HD-ZLZ-START結(jié)構(gòu)域亞家族。在HD-ZLZ-START 結(jié)構(gòu)域亞家族中，已被報(bào)道具有生物學(xué)功能的有ATML1、PDF2、FWA、GL2 和AtEDT1，其中ATML1 和PDF2 通過(guò)與其啟動(dòng)子區(qū)高度保守的L1 Box 結(jié)合來(lái)調(diào)控相關(guān)特異性基因表達(dá)［15］。atml-1 pdf2-1雙突變體表現(xiàn)出嚴(yán)重的幼苗生長(zhǎng)遲緩，芽表皮分生組織缺陷以及開(kāi)花前生長(zhǎng)遲滯的現(xiàn)象，對(duì)單基因不同位點(diǎn)突變體分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATML1 和PDF2 是胚胎發(fā)生過(guò)程中所必需的［16］。FWA 的過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植株花序發(fā)生異常。ANL2 參與花青素的積累和皮層的發(fā)育，anl2突變體不僅在花青素積累存在缺陷［17］，而且在根的皮層發(fā)育中也存在缺陷。GL2基因缺失后，擬南芥表皮毛數(shù)量及分枝數(shù)表現(xiàn)出顯著的增多［18］，AtEDT1在擬南芥中過(guò)表達(dá)后可以促進(jìn)根系的伸長(zhǎng)，提高植物對(duì)深層土壤水分的吸收，從而提高抗旱性［19］。HD-ZIP-START 結(jié)構(gòu)域亞家族中PHB、PHV 和REV胚胎發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，rev 突變體葉片面積增大并發(fā)生卷曲，rev/phv雙重突變體出現(xiàn)喇叭狀葉片，近軸面表現(xiàn)出遠(yuǎn)軸面特性，rev/phb/phv三重突變體的葉片幾乎全是喇叭狀，遠(yuǎn)軸化特征加?。?0］。擬南芥PH-START-DUF1336 結(jié)構(gòu)域亞家族和STARTDUF1336結(jié)構(gòu)域亞家族成員生物學(xué)功能尚未見(jiàn)報(bào)道，僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族成員除本實(shí)驗(yàn)室前期在逆境脅迫下有關(guān)報(bào)道外，也尚未見(jiàn)其它研究［21］。

本研究利用生物信息學(xué)方法，對(duì)擬南芥START結(jié)構(gòu)域家族成員進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子作用元件進(jìn)行分析；利用qRT-PCR 技術(shù)分析了編碼僅含START 結(jié)構(gòu)域蛋白基因在擬南芥發(fā)育不同部位的表達(dá)量，并對(duì)僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族的8 個(gè)成員的功能獲得和功能缺失轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗形態(tài)進(jìn)行了觀察，為闡述START 結(jié)構(gòu)域在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

哥倫比亞野生型擬南芥（Arabidopsis thalianaColumbia, Col-0）和僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族功能獲得轉(zhuǎn)基因植株種子均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

擬南芥僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族成員的T-DNA插 入 突 變 體（SALK-106413C、SALK-053628、SALK-093319、SALK-053261、SALK-102986、SALK-006629、GK-067A04 和GK-056A02），均購(gòu)于美國(guó)ABRC（Arabidopsisiological Resource Center）突變體庫(kù)，將其依次編號(hào)為stard1～stard8。

1.2 擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

從 TAIR（The Arabidopsis Information Resource）數(shù)據(jù)庫(kù)下載擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族成員的蛋白序列，利用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，利用MEGA7.0 軟件分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，統(tǒng)計(jì)方法為NJ 法。

1.3 擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam（web.expasy.org/protscale/）對(duì)擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族成員的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，利用NCBI 的CD-search 工具預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域的位置信息。

1.4 擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族的基因結(jié)構(gòu)分析

利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站獲取START 結(jié)構(gòu)域家族成員的基因序列和CDS序列，利用在線工具GSDS（https://www.himiku.com/amp/gsds）繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.5 擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族的啟動(dòng)子作用元件分析

基于公共數(shù)據(jù)平臺(tái)NCBI 下載關(guān)于擬南芥基因組的注釋信息，使用TBTOOLS 軟件中的Gtf/Gff3 序列提取工具，選取含START 結(jié)構(gòu)域家族成員CDS 上游2 000 bp 的啟動(dòng)子序列，將提取到的序列提交至plantcare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/）進(jìn)行順式元件預(yù)測(cè)，根據(jù)反饋結(jié)果，使用TBTOOLS 軟件中的生物序列查看（BioSequence viewer）功能對(duì)擬南芥含START 結(jié)構(gòu)域家族成員的啟動(dòng)子作用元件進(jìn)行可視化分析。

1.6 擬南芥的種植及RNA 的提取

先將擬南芥種子進(jìn)行消毒殺菌，然后均勻的撒在盛有MS 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中使其萌發(fā)（過(guò)表達(dá)株系種子撒種在含0.1%潮霉素的MS 培養(yǎng)基），用封口膜封好后放在4 ℃冰箱春化2 ～3 d，取出轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為20 ℃，光照條件為16 h 光照和8 h 黑暗交替進(jìn)行，待幼苗長(zhǎng)到4 片真葉時(shí)，將幼苗從培養(yǎng)皿中移植到蛭石和營(yíng)養(yǎng)土1∶1（v/v）的培養(yǎng)盒中，并定期澆營(yíng)養(yǎng)液保證其正常生長(zhǎng)。

待擬南芥生長(zhǎng)至4 周大小時(shí)，分別取擬南芥的根、莖、蓮座葉和莖生葉等不同的組織和轉(zhuǎn)基因植株成熟蓮座葉，放入液氮后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。提取RNA 步驟參考全式金Trzol 法（詳細(xì)步驟參考說(shuō)明書）。cDNA 第一條鏈的合成使用蘇州宇恒生物科技公司UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis( with dsDNase)試劑盒操作說(shuō)明書步驟完成，每次設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.7 表達(dá)水平的測(cè)定

擬南芥樣品總RNA 的提取完成后，采用TaKaRa PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒，反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA 鏈，利用內(nèi)參基因UBQ5和編碼僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族基因的特異性引物，參照 TransStart Tip Green qPCR Super Mix 說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。每個(gè)處理3 次重復(fù)，且以野生型在不同部位表達(dá)量為1 的基因轉(zhuǎn)錄水平作對(duì)照，采用比較 Ct 值法（2-ΔΔCt法）分析各個(gè)基因在擬南芥的不同部位和不同轉(zhuǎn)基因植株中的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 引物設(shè)計(jì)

利用Prime 5.0（加拿大Premier 公司）、NCBI網(wǎng) 站Primer-blast 和DNAMAN（ 美 國(guó) 的Lynnon Biosoft 公司）設(shè)計(jì)引物。本試驗(yàn)所用相關(guān)引物均為通用生物有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)中所需引物Table 1 Primers needed in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥START 結(jié)構(gòu)域蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了解START 結(jié)構(gòu)域蛋白家族的進(jìn)化關(guān)系，以擬南芥含START 結(jié)構(gòu)域35 個(gè)成員的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)合前期研究，根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域的不同，將擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族35 個(gè)成員分為5 個(gè)亞家族，HD-ZIP-START 亞家族有5 個(gè)成員，PH-START-DUF1336 亞家族有4 個(gè)成員，START-DUF1336 亞家族有1 個(gè)成員，僅含START結(jié)構(gòu)域亞家族有9 個(gè)成員。如圖1 所示，加粗部分為僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族成員，可以看出，9 個(gè)成員共分布在4 個(gè)大分枝上，At4g26920 和At5g07260在同一個(gè)分枝，與其它成員親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 擬南芥含START 結(jié)構(gòu)域基因進(jìn)化關(guān)系分析Fig.1 Analysis on the evolutionary relationship of Arabidopsis genes containing START domain

2.2 擬南芥START 結(jié)構(gòu)域蛋白家族的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam、ProtScale 對(duì)擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族成員的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示（表2），該家族成員不穩(wěn)定系數(shù)為36.92 ～58.65，大多數(shù)成員不穩(wěn)定系數(shù)在40 以上，表明結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。其中含START 結(jié)構(gòu)域的多結(jié)構(gòu)域亞家族等電點(diǎn)pI＜7 的蛋白達(dá)到88%以上，多數(shù)為酸性氨基酸。而僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族等電點(diǎn)pI ＞7 的蛋白達(dá)到88%以上，多數(shù)為堿性氨基酸。

表2 擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族蛋白理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of Arabidopsis START domain family proteins

跨膜片段預(yù)測(cè)顯示，在擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族中，只有僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族存在跨膜片段，其中At3g13062、At1g55960、At3g23080 和At1g64720 蛋白氨基末端包含單個(gè)跨膜片段，序列相似性較高的At4g14500 和At5g54170 均含有2 個(gè)跨膜片段，

利用NCBI 的CD-search 工具預(yù)測(cè)基因的保守結(jié)構(gòu)域的位置，發(fā)現(xiàn)START 結(jié)構(gòu)域的大小在不同亞家族中出現(xiàn)明顯變化，在HD-ZLZ-START 亞家族中START 結(jié)構(gòu)域從羧基端開(kāi)始定位至大約470 個(gè)氨基酸的位置，HD-ZIP-START 亞家族中START 結(jié)構(gòu)域從羧基端開(kāi)始定位至大約370個(gè)氨基酸的位置，PH-START-DUF1336 亞家族中START 結(jié)構(gòu)域亞家族中START 結(jié)構(gòu)域位于2 個(gè)結(jié)構(gòu)域之間，而僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族START 結(jié)構(gòu)域從羧基端開(kāi)始定位至大約300 個(gè)氨基酸的位置，位置的差異可能導(dǎo)致功能上的改變（表3）。

表3 擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族START 結(jié)構(gòu)域分析Table 3 Analysis of START domain of Arabidopsis START domain family

續(xù)表：

2.3 擬南芥START 結(jié)構(gòu)域蛋白家族的基因結(jié)構(gòu)分析

內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)的多樣性也暗示基因在進(jìn)化過(guò)程中復(fù)雜功能，其中外顯子作為基因中的保守部分，對(duì)判斷生物演化提供依據(jù)。結(jié)果如圖2，編碼START 結(jié)構(gòu)域基因具有相對(duì)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，所有基因均被內(nèi)含子打斷。編碼僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族的基因外顯子數(shù)目均為6 個(gè)以下，其中At5g49800最少，只含有4 個(gè)外顯子，而編碼含START 結(jié)構(gòu)域的多結(jié)構(gòu)域亞家族的基因其外顯子數(shù)目明顯增多，編碼含PH-START-DUF1336 結(jié)構(gòu)域蛋白的基因外顯子數(shù)目均為15 個(gè)以上，結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。上述結(jié)果表明，隨著擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族的進(jìn)化，外顯子/內(nèi)含子的數(shù)目也在變化，相同亞家族間比較保守，可能具有類似的生物學(xué)功能。

圖2 擬南芥含START 結(jié)構(gòu)域基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of gene structure of Arabidopsis gene containing START domain

2.4 擬南芥START 結(jié)構(gòu)域蛋白家族的啟動(dòng)子作用元件分析

通過(guò)在線網(wǎng)站phytozome 獲取編碼START 結(jié)構(gòu)域蛋白家族基因上游2 000 bp 作為啟動(dòng)子序列，鑒定出的啟動(dòng)子作用元件與植物生長(zhǎng)發(fā)育，激素和脅迫響應(yīng)具有一定關(guān)聯(lián)。其中與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的有分生組織表達(dá)調(diào)控元件（CAT-box）、玉米醇溶蛋白代謝元件（O2-site）、胚乳特異性表達(dá)元件（Element involved in Endosperm Expression）等，與激素相關(guān)有脫落酸（abscisic acid，ABA）響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MEJA）響應(yīng)元件，生長(zhǎng)素（TGA-element）響應(yīng)元件等。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)編碼START 結(jié)構(gòu)域蛋白家族的基因中還含有響應(yīng)非生物脅迫的作用元件且在多個(gè)基因中被鑒定出，如：干旱脅迫響應(yīng)元件（MBS）、低溫響應(yīng)元件（LTRmotif）等。此外，START 結(jié)構(gòu)域不同亞家族成員啟動(dòng)子區(qū)作用元件類型有差異，如僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族大部分成員含有分生組織表達(dá)調(diào)控元件、玉米醇溶蛋白代謝元件和低溫響應(yīng)元件，其它多結(jié)構(gòu)域亞家族中啟動(dòng)子區(qū)相應(yīng)元件較少，而赤霉素作用元件（P-box）和赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif）在僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族大部分成員中缺失，在其它多結(jié)構(gòu)域亞家族中較多（圖3）。

圖3 擬南芥含START 結(jié)構(gòu)域基因啟動(dòng)子作用元件分析Fig.3 Analysis of the role elements of Arabidopsis thaliana gene promoter containing START domain

2.5 僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族在擬南芥不同組織表達(dá)分析

利用qRT-PCR 技術(shù)分析僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族成員在擬南芥不同器官的表達(dá)量。結(jié)果如圖4 所 示。其 中At1g55960、At5g54170、At4g26920和At5g07260 在不同組織中表達(dá)量存在明顯差異，在種子中表達(dá)量較高，在其它組織中表達(dá)量較少，At3g13062、At3g23080、At4g14500 和At1g64720在蓮座葉和莖生葉中表達(dá)量較高。

圖4 擬南芥僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族在不同部位的表達(dá)量Fig.4 Arabidopsis only contains the expression levels of the START domain subfamily in different parts

2.6 擬南芥僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族突變體鑒定

取過(guò)表達(dá)與突變體植株的成熟蓮座葉，進(jìn)行qRT-PCR 表達(dá)量驗(yàn)證（圖5）。qRT-PCR 結(jié)果表明，所選取的過(guò)表達(dá)擬南芥內(nèi)編碼僅含START 結(jié)構(gòu)域基因表達(dá)量均高于野生型，突變體植株內(nèi)編碼僅含START 結(jié)構(gòu)域基因的表達(dá)量均低于野生型。為了方便命名，我們將驗(yàn)證好的過(guò)表達(dá)植株按表達(dá)量由高到低命名為OE-1、OE-2、OE-3，后續(xù)表型觀察選取過(guò)表達(dá)植株的一個(gè)株系并命名為At3g13062-OE、At1g55960-OE、At3g23080-OE、At4g14500-OE、At5g54170-OE、At1g64720- OE、At4g26920-OE 和At5g07260-OE；各自的T-DNA 插入突變體用At3g13062-T、At1g55960-T、At3g23080-T、At4g14500-T、At5g54170-T、At1g64720- T、At4g26920-T 和At5g07260-T 表示。

圖5 僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族過(guò)表達(dá)和突變體植株的驗(yàn)證Fig.5 Validation of overexpression of subfamily containing only START domain and mutant lines

2.7 擬南芥幼苗表型觀察

將野生型、過(guò)表達(dá)和突變體植株種子春化后正常培養(yǎng)14 d 后對(duì)幼苗進(jìn)行觀察。如圖6 所示，與野生型相比，過(guò)表達(dá)植株幼苗出現(xiàn)了極性的改變，但葉片大小未發(fā)生改變。At1g55960 過(guò)表達(dá)幼苗真葉葉柄短粗，At3g23080 過(guò)表達(dá)幼苗葉片發(fā)生卷曲，第一對(duì)真葉在近軸面出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表型，At5g54170 和At4g26920 過(guò)表達(dá)幼苗真葉出現(xiàn)非對(duì)稱生長(zhǎng)，同時(shí)期野生型有一對(duì)子葉和兩對(duì)真葉，而At3g13062、At4g14500 和At1g64720 過(guò)表達(dá)幼苗第一對(duì)真葉只長(zhǎng)出一片葉子，葉片發(fā)育明顯受阻。突變體對(duì)稱性也出現(xiàn)變化，但極性發(fā)生改變的程度不如過(guò)表達(dá)嚴(yán)重。上述結(jié)果表明，僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族成員表達(dá)量的改變會(huì)影響擬南芥幼苗期的發(fā)育。

圖6 幼苗時(shí)期表型觀察Fig.6 Phenotype observation at the seedling stage

3 討論與結(jié)論

START 結(jié)構(gòu)域是一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，主要參與脂質(zhì)運(yùn)輸、代謝和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于它具有和脂質(zhì)配體的物質(zhì)結(jié)合的特性，可以結(jié)合不同的配體。START 結(jié)構(gòu)域在動(dòng)物中負(fù)責(zé)將急性調(diào)節(jié)蛋白中的膽固醇運(yùn)輸?shù)骄€粒體內(nèi)膜，而在之后的研究中證明，人類的諸多疾病都與START 結(jié)構(gòu)域蛋白密切相關(guān)［1-2］。

目前為止，START 結(jié)構(gòu)域在多個(gè)物種中被鑒定出，其中水稻有29 個(gè)，擬南芥有35 個(gè)，人和小鼠中各有15 個(gè)，秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅分別有7 個(gè)和4 個(gè)。在動(dòng)物和植物中，大多數(shù)含START 結(jié)構(gòu)域蛋白已經(jīng)發(fā)生不同的進(jìn)化。RhoGAP-START 結(jié)構(gòu)域僅存在于動(dòng)物中，植物中不存在。但在植物中出現(xiàn)了2 個(gè)動(dòng)物中不存在的HD-START 結(jié)構(gòu)域亞家族，這些植物特有的START 結(jié)構(gòu)域蛋白在雙子葉和單子葉植物中均被克隆到，進(jìn)化關(guān)系上，它們起源于植物譜系的一個(gè)古老祖先。不同結(jié)構(gòu)域的組合可能提高了植物在脂質(zhì)或甾醇類信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

PHB 顯性突變體Phb-1d 是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的葉片極性缺陷突變體［20］，在成熟蓮座葉中出現(xiàn)近軸化的針狀葉和棒狀葉。調(diào)控葉片近軸面化基因還有PHV，它們的突變體均在葉的邊緣處出現(xiàn)近軸化的表型，葉片呈現(xiàn)棒狀和荷葉狀，這兩者表型十分類似。同屬該家族的還有REV，且擬南芥rev 突變體葉片增大并卷曲。本研究中僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族在幼苗葉片發(fā)育時(shí)表現(xiàn)出和野生型明顯的差異，子葉向下卷曲，過(guò)表達(dá)植株第2 片真葉無(wú)法生長(zhǎng)，植株對(duì)稱性發(fā)生下降。突變體植株中也出現(xiàn)這種情況，但并沒(méi)有過(guò)表達(dá)植株明顯。這說(shuō)明START 結(jié)構(gòu)域本身就具有調(diào)控近遠(yuǎn)軸極性建成的作用。

對(duì)僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族成員突變體和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗形態(tài)比較發(fā)現(xiàn)，各成員的過(guò)表達(dá)植株均表現(xiàn)為不同程度的非對(duì)稱生長(zhǎng)特性，結(jié)合過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥中目的基因的表達(dá)水平分析，At1g55960 和At5g07260 的過(guò)表達(dá)水平很高，分別達(dá)到野生型的16 倍和47 倍（圖5），但這2個(gè)成員的過(guò)表達(dá)植株的表型并未表現(xiàn)為比其它成員的過(guò)表達(dá)植株（基因表達(dá)水平均是野生型得10 倍以下）更為嚴(yán)重的表型（圖6）。這可能與各亞家族成員在組織水平的表達(dá)特異性相關(guān)，因?yàn)楸狙芯坑^察的是幼苗形態(tài)，分析的是蓮座葉的生長(zhǎng)發(fā)育，而At1g55960 和At5g07260 在蓮座葉表達(dá)水平很低（圖4），而過(guò)表達(dá)植株表型嚴(yán)重的At3g13062、At4g14500 和At1g64720 均在蓮座葉中表達(dá)量較高（圖4、圖6），暗示著亞家族成員在幼苗期的生物學(xué)功能與其表達(dá)特性密切相關(guān)。

研究還發(fā)現(xiàn)僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族成員的T-DNA 插入突變體的表型不如過(guò)表達(dá)植株明顯，但也表現(xiàn)出第2對(duì)真葉非對(duì)稱生長(zhǎng)和發(fā)育受阻的表型，這說(shuō)明START 結(jié)構(gòu)域在植物中的功能可能與在動(dòng)物中相似，表達(dá)量過(guò)高和過(guò)低均會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，之所以T-DNA 插入突變體表型不如過(guò)表達(dá)植株明顯，可能是該亞家族成員的功能冗余原因所致。

綜上所述，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法和qRTPCR 技術(shù)，對(duì)擬南芥START 結(jié)構(gòu)域家族成員進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育、理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子作用元件和組織表達(dá)特異性分析，并結(jié)合對(duì)僅含START 結(jié)構(gòu)域亞家族功能獲得和功能缺失轉(zhuǎn)基因擬南芥表型的觀察，發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)程，為下一步探究其功能和作用機(jī)制提供理論依據(jù)。