吳曉敏 袁曉輝 薛書蕾 查嶺生 王光利 張海軍，*

(1淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，資源植物生物學(xué)安徽省重點實驗室，安徽淮北235000;2東北林業(yè)大學(xué)生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，哈爾濱150040;3暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，廣州510632)

1 引 言

蛋白質(zhì)不僅是生命體的重要結(jié)構(gòu)組成部分，而且也是生物體內(nèi)多種功能的實現(xiàn)者;1其結(jié)構(gòu)的動力學(xué)行為，特別是天然態(tài)結(jié)構(gòu)的折疊形成過程對其生物功能的實現(xiàn)是至關(guān)重要的.2?5許多疾病都是由蛋白質(zhì)折疊異?；蚪Y(jié)構(gòu)破壞引起的，如老年癡呆癥(蛋白質(zhì)構(gòu)象變化)、囊性纖維病變(蛋白質(zhì)不能折疊)、家族性高膽固醇癥(蛋白質(zhì)錯誤折疊)、家族性淀粉樣蛋白癥(蛋白質(zhì)沉淀)等等.6?9因此，理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊機(jī)制及其與生物功能之間的相互關(guān)系一直是蛋白質(zhì)科學(xué)領(lǐng)域中非常重要的研究內(nèi)容，并且該研究也受到越來越多不同學(xué)科領(lǐng)域研究工作者的高度重視.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊轉(zhuǎn)變機(jī)制的研究不但可以解釋生物體中各種功能的實現(xiàn)等基礎(chǔ)理論問題，而且還具有重要的現(xiàn)實意義.10，11它可以為尋找更有效的藥物靶標(biāo)位置，改善藥物結(jié)構(gòu)以及提高藥物效能等提供重要的理論依據(jù).深入研究蛋白質(zhì)的折疊與解折疊機(jī)制，重構(gòu)構(gòu)象躍遷過渡路徑，發(fā)現(xiàn)折疊過程中的中間態(tài)、過渡態(tài)，對于理解它的結(jié)構(gòu)特征和折疊動力學(xué)行為，特別是認(rèn)識它天然態(tài)結(jié)構(gòu)的折疊與解折疊轉(zhuǎn)變過程具有重要的生物學(xué)意義，并且對醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域都將產(chǎn)生重大影響.

本文首先概述了蛋白質(zhì)折疊研究目前在實驗和理論模擬方面存在的問題，然后以結(jié)構(gòu)典型且可快速折疊的人工設(shè)計多肽Trp-cage為例，概述Trpcage的折疊動力學(xué)行為分別在實驗和理論模擬計算方面的研究進(jìn)展，并對其折疊過渡溫度、折疊形成模型及其肽鏈上關(guān)鍵氨基酸殘基在折疊過程中的作用三個方面進(jìn)行了詳細(xì)討論與總結(jié)，最后就如何有效化解蛋白質(zhì)殘基間相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而降低其折疊機(jī)制的復(fù)雜性提出了一些新的建議.

2 蛋白質(zhì)折疊機(jī)制研究中存在的問題

2.1 折疊機(jī)制實驗研究方面

目前適用于生物大分子結(jié)構(gòu)研究的生物物理實驗技術(shù)(如核磁共振、X射線衍射、電子衍射、單分子熒光技術(shù)、時間分辨熒光技術(shù)、氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)和溫度跳躍技術(shù)等)發(fā)展迅猛，可以通過實驗解析構(gòu)建原子分辨率水平的三維結(jié)構(gòu)模型，也能夠清楚地測定蛋白質(zhì)構(gòu)象變化及其折疊動力學(xué)等特征，但缺點是現(xiàn)有實驗手段測定的動力學(xué)結(jié)構(gòu)特征也僅是時間和空間上的平均結(jié)果，難以真正反映出蛋白質(zhì)的折疊轉(zhuǎn)變的微觀細(xì)節(jié)過程以及與功能實現(xiàn)緊密相關(guān)的動力學(xué)過程.12，13盡管目前用于測定蛋白質(zhì)構(gòu)象變化動力學(xué)等特征的實驗技術(shù)分辨率已達(dá)到10?10m，但缺點是生物分子體系中含氫基團(tuán)極多，1H核磁共振波譜線易重疊而不易解析;14，15盡管目前的氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)也能利用蛋白質(zhì)與溶劑分子之間的氫氘交換反應(yīng)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，但蛋白骨架中與α-碳原子共價結(jié)合的氫原子無法參與氫氘交換反應(yīng)，而蛋白側(cè)鏈上的氫原子參與的氫氘交換反應(yīng)速率又極快，難以進(jìn)行有效檢測;16，17其次是由于蛋白質(zhì)完成自我折疊轉(zhuǎn)變過程的時間尺度往往在10?3?10?6s范圍內(nèi)，如此短的時間尺度是目前儀器分析手段所難以進(jìn)行直接觀測的，再加上時間分辨率的提高要比空間分辨率的提高困難得多，而目前能觀測到微秒級、納秒級時間尺度內(nèi)分子運(yùn)動的儀器恐怕現(xiàn)有技術(shù)條件較難達(dá)到.另外實驗條件往往不易精確控制，得到的結(jié)果可能會產(chǎn)生較大的偏差，上述問題都給蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊機(jī)制的實驗研究帶來很大的困擾.

2.2 折疊機(jī)制理論計算研究方面

理論計算模擬在空間和時間分辨率上分別可以達(dá)到納米級和飛秒級，在時空分辨率精度上可以突破這個局限性，能夠排除其它因素的干擾，并可獲得任意微觀量的時空分布和演化軌跡，在一定程度上彌補(bǔ)了目前實驗所遇到的這些制約瓶頸，但在模擬時間尺度上也存在一定的缺陷.18?20生物大分子中的氫原子波動頻率較快，導(dǎo)致時間步長設(shè)定不能太長，通常模擬設(shè)定在飛秒級，而這又導(dǎo)致模擬計算耗時較長，對計算機(jī)性能要求較高.盡管在模擬過程中可以通過選擇Shake或者Rattle算法將模擬體系中氫原子的振動自由度消除，進(jìn)而選擇較大的步長，但會增加額外計算求解約束方程，導(dǎo)致模擬計算效率并不高.另外，蛋白質(zhì)折疊都是發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的溶液中，這也就要求模擬采用更為真實的顯式溶劑水分子，而處理大量水分子的運(yùn)動將消耗大量機(jī)時，而有效肽鏈的運(yùn)動又很少.這也導(dǎo)致我們目前模擬計算時間尺度受限，其模擬計算結(jié)果與其實驗研究的大時間尺度仍未達(dá)到完全匹配，無法真正觀察清楚蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的折疊細(xì)節(jié)與全局過程.12，13為了提高現(xiàn)今模擬計算的時間尺度，一方面隨著計算機(jī)硬件水平的快速發(fā)展，一些理論計算課題組率先開發(fā)出超級計算機(jī)(Anton)，并將全原子分子動力學(xué)(MD)的模擬時間尺度提高到微秒級、甚至毫秒級，并能成功地模擬計算出不同類型結(jié)構(gòu)特征模型蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變機(jī)制和折疊形成路徑;21，22另一方面，很多理論工作者通過對生物大分子骨架和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的運(yùn)動規(guī)律的研究，提出并發(fā)展出很多粗?；Ｐ?如 HP model，lattice model，g?-like model和native-centric model等)和相關(guān)的模型理論(如hybrid theory，nonexplicit-chain theory等)，達(dá)到準(zhǔn)確描述生物體系(尤其是大分子蛋白質(zhì)、本質(zhì)無序蛋白質(zhì)(IDP))分子結(jié)構(gòu)運(yùn)動規(guī)律進(jìn)而提高計算效率.23這些研究工作進(jìn)展都大大提高了目前折疊機(jī)制理論計算的研究水平.

由于蛋白質(zhì)具有很高的自由度及其過渡態(tài)呈現(xiàn)的不穩(wěn)定性，實驗上很難直接捕捉到蛋白質(zhì)過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)特征，而理論計算方法能夠通過主成分分析(PCA)或直接測定回旋半徑(radius of gyration，Rg)、均方根偏差(RMSD)、天然接觸形成率(content of native contacts，ρNC)、折疊/解折疊速率(folding/unfolding rate，rF/U)等重要結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)而構(gòu)建出折疊的自由能曲面(free energy landscape)，清晰勾勒出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊的熱力學(xué)特征，同時通過獲取折疊過程中各個中間態(tài)以及過渡態(tài)等詳細(xì)的結(jié)構(gòu)特征并推斷其折疊動力學(xué)行為，在一定程度上彌補(bǔ)了實驗方面的不足.目前分子動力學(xué)模擬己經(jīng)成為在原子水平上研究蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)性質(zhì)的一個重要工具.20，24，25迄今為止，從早期的格點模型到現(xiàn)今更為精確的粗?；Ｐ鸵约叭幽Ｐ?，人們提出并發(fā)展了很多理論.在這些折疊理論中，被廣泛接受的是蛋白質(zhì)折疊的漏斗理論，26?29即蛋白質(zhì)從伸展的非天然態(tài)開始，折疊過程沿著能量表面下坡方向運(yùn)動，整個過程受熱力學(xué)和動力學(xué)的控制，最終可以達(dá)到動力學(xué)上可及并且熱力學(xué)上最穩(wěn)定的態(tài)(即蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的天然態(tài)).該天然態(tài)也對應(yīng)著自由能最小態(tài)，但自由能的極小并不意味著勢能的極小，其中還包含著熵的作用.此外，蛋白質(zhì)能夠通過多種折疊路徑最終形成天然態(tài)，而折疊路徑的選擇又取決于環(huán)境和初始結(jié)構(gòu)等條件的影響，30由于折疊問題的復(fù)雜性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞體內(nèi)如何快速準(zhǔn)確地折疊到其功能結(jié)構(gòu)至今仍未完全解決.

相對于蛋白質(zhì)折疊的微秒級、毫秒級甚至秒級時間尺度來說，目前分子動力學(xué)模擬計算能力仍然存在技術(shù)上的巨大挑戰(zhàn)，這也導(dǎo)致目前的折疊理論計算研究通常應(yīng)用在折疊迅速且結(jié)構(gòu)典型的模型多肽(如β-hairpin、31?34Amyloid、35?40Melittin41?43和Trp-cage43?46等)，小分子量蛋白質(zhì)或蛋白結(jié)構(gòu)域(如chymotrypsin inhibitor 2、47，48Lysozyme、49?51zinc-finer motif、52，53B domain of protein A/G21，54?58和WW-domain22，59等)等典型折疊機(jī)制的研究上，而一些具有重要生物功能的大蛋白質(zhì)體系構(gòu)象折疊轉(zhuǎn)變過程還是無法直接通過理論計算得到.其次，目前對生物大分子結(jié)構(gòu)及其體系相互作用的描述依然停留在經(jīng)典的牛頓力學(xué)基礎(chǔ)上，各種流行理論計算模擬軟件主要是采用OPLS/AA、60，61GROMACS、62，63CVFF、33，53AMBER、64CHARMM65等常用力場，盡管已有很多模擬計算結(jié)果表明這些分子力場能夠很好地應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊轉(zhuǎn)變的研究.但這些力場對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分子間非鍵相互作用的描述無法隨著模擬環(huán)境(如pH、溫度、離子濃度、溶劑極化效應(yīng)等)的變化而調(diào)整，目前還達(dá)不到準(zhǔn)確描述不同環(huán)境下蛋白質(zhì)體系相互作用的復(fù)雜性.盡管近年來極化力場的提出和發(fā)展彌補(bǔ)了過去傳統(tǒng)分子力場描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)體系相互作用的不準(zhǔn)確性，66，67但由于極化力場的參數(shù)繁多且復(fù)雜，導(dǎo)致其對蛋白質(zhì)這樣的生物大分子體系折疊研究可行性不高.68因此在未來的折疊理論計算方面會進(jìn)一步發(fā)展更簡單更準(zhǔn)確的力場或者設(shè)計更加有效研究折疊過程的新方法.69，70

3 模型多肽Trp-cage折疊形成機(jī)制的研究進(jìn)展

以模型多肽Trp-cage為例，Trp-cage是一個由20個氨基酸組成的人工設(shè)計蛋白，它包含一段α-螺旋(Leu2?Asp9)和一段短的310-螺旋二級結(jié)構(gòu)(Gly10?Ser14)及其一段C端的多脯氨酸II螺旋結(jié)構(gòu)(Pro17?Pro19).模型多肽Trp-cage上N端螺旋上殘基Tyr3、Trp6、Leu7、Pro12與C端中連續(xù)的三個脯氨酸(Pro17，Pro18和Pro19)一起形成了一個以Trp6為中心的疏水核，具有緊湊、明確的三級結(jié)構(gòu)(圖1A).模型多肽Trp-cage分子量小，結(jié)構(gòu)典型且可快速折疊(約4 μs)，一直被看作是研究蛋白質(zhì)折疊轉(zhuǎn)變機(jī)制的理想模型.71，72

3.1 Trp-cage的折疊過渡溫度

目前國內(nèi)外科研工作者通過核磁共振(NMR)、45，71圓二色(CD)光譜、72?74熒光猝滅光譜(FQCTS)、75?77紫外共振拉曼光譜(URRS)78等實驗手段對模型多肽Trp-cage的折疊機(jī)制都已進(jìn)行過深入的研究，結(jié)果表明其折疊過程可在1.0?4.1 μs范圍內(nèi)完成，該結(jié)果也得到了理論模擬計算的驗證.79?84然而，目前對于模型多肽Trp-cage的一些具體的折疊細(xì)節(jié)過程仍然存在很大爭議和疑問.例如Qiu等72通過跳溫波譜技術(shù)(TJS)研究表明模型多肽Trp-cage通過兩態(tài)協(xié)同的方式完成折疊過程;但Neuweiler73和Ahmed78課題組發(fā)現(xiàn)模型多肽Trp-cage并非只是一個簡單的兩態(tài)折疊蛋白;還有一些課題組利用分子動力學(xué)模擬方法對Trp-cage的折疊路徑和機(jī)理進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn):Trp-cage折疊轉(zhuǎn)變過程中過渡態(tài)形成的溫度約為400 K80或更高溫度，79，81未能重復(fù)得出實驗所得到的過渡態(tài)的溫度(315 K);72而Day、85Duan86和Zhang87等對Trp-cage折疊過程進(jìn)行的副本交換分子動力學(xué)(REMD)模擬發(fā)現(xiàn)，溶解溫度可以和實驗值相吻合.通過分析比較可以推測，這些模擬計算結(jié)果的差異性主要是由于動力學(xué)模擬所采用分子力場與溶劑模型的不同.基于這種模擬計算和實驗研究結(jié)果的不一致，最近O?dziej等45采用二維核磁共振技術(shù)與分子動力學(xué)模擬相結(jié)合的方法對Trp-cage的折疊過渡溫度進(jìn)行了研究，結(jié)果表明:由于模型多肽Trpcage折疊復(fù)雜性(關(guān)鍵氨基酸Trp6和Pro12的疏水長程協(xié)同作用與N端α-helix解旋過程同時發(fā)生)，其折疊過渡溫度并非在某一溫度時刻，而是在311?317 K范圍內(nèi).

圖1 模型多肽Trp-cage71(A)及其突變體P12W(Trp2-cage)98(B)的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic structures of the Trp-cage mini-protein71(A)and its mutant P12W(Trp2-cage)98(B)

3.2 Trp-cage的折疊形成機(jī)制

目前對于模型多肽Trp-cage折疊過程中各個折疊細(xì)節(jié)發(fā)生的順序一直都未達(dá)成共識.例如國內(nèi)外一些研究蛋白折疊課題組發(fā)現(xiàn)鹽橋Asp9/Arg16的率先形成對模型多肽Trp-cage的折疊發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，70，71，81然而這恰恰與實驗得到的結(jié)果相反.通過圓二色譜實驗研究發(fā)現(xiàn)，將鹽橋Asp9/Arg16去掉后，模型多肽Trp-cage的折疊時間未發(fā)生明顯的變化，73并且最近研究也發(fā)現(xiàn)模擬計算起始構(gòu)象中的鹽橋Asp9/Arg16甚至并不能穩(wěn)定存在，在模擬過程中會發(fā)生斷裂消失，并且N端α-helix的穩(wěn)定存在與其形成具有緊密聯(lián)系.45Chowdhury82和Hu83等運(yùn)用全原子分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)疏水核心Trp6的包埋掩藏是模型多肽Trp-cage折疊過程的關(guān)鍵限速步驟，而Juraszek等84采用副本交換分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)Trp-cage折疊過程的限速步驟并非絕對為疏水核心吲哚環(huán)的包埋，其研究結(jié)果表明模型多肽Trpcage N-端上的α-螺旋結(jié)構(gòu)形成于折疊過程的早期，之后疏水殘基逐漸向疏水核心(Trp6)靠攏，最終疏水核中的Trp6側(cè)鏈上的吲哚環(huán)完整包埋而結(jié)束整個折疊過程.Mok等88通過脈沖光譜實驗研究發(fā)現(xiàn)在非折疊態(tài)結(jié)構(gòu)的Trp-cage中存在疏水核結(jié)構(gòu)，說明疏水核的塌陷推動蛋白結(jié)構(gòu)的整個折疊進(jìn)程，即所謂的疏水塌陷模型.89?92Trp-cage這種疏水塌陷折疊模型的提出也得到了其他課題組的支持，而Ahmed課題組78發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)中N端的α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成先于疏水核的塌陷，Juraszek課題組84卻認(rèn)為Trpcage的折疊形成遵循成核-聚集和擴(kuò)散-碰撞模型.可見，雖然模型多肽Trp-cage只有20個氨基酸組成，且其結(jié)構(gòu)簡單緊湊且折疊迅速，但其折疊機(jī)制仍然存在爭議.

為了探究該模型多肽Trp-cage復(fù)雜的折疊過程，我們曾采用溫控分子動力學(xué)(TCMD)方法93對模型多肽Trp-cage在真空和水溶劑條件下的折疊與解折疊過程進(jìn)行了深入的研究，得到了Trp-cage折疊過程中的重要中間態(tài)結(jié)構(gòu)，為其折疊與解折疊機(jī)制的揭示提供了直接、可靠的依據(jù);70結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶劑水分子可通過疏水作用誘導(dǎo)Trp-cage形成一個亞穩(wěn)態(tài)(MSOL)和一個非天然態(tài)疏水核的過渡態(tài)(TS)結(jié)構(gòu)，推動肽鏈?zhǔn)杷畾埢g的相互作用，進(jìn)而促進(jìn)肽鏈結(jié)構(gòu)疏水核的快速收縮和正確折疊.為深入理解Trpcage天然折疊態(tài)構(gòu)型的穩(wěn)定形成機(jī)制，我們采用分子動力學(xué)結(jié)合殘基點突變(甘氨酸替換)的方法研究Trp-cage中各個氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)在其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用，通過與野生天然態(tài)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征數(shù)據(jù)對比，確定了每個殘基側(cè)鏈在其整個結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用.如殘基Tyr3與Pro19間的疏水作用、殘基Ser14和Arg16間的氫鍵作用以及Pro17所形成的三級天然接觸等穩(wěn)定作用對Trp-cage整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著特殊重要的作用(圖2).另外，具有相同側(cè)鏈的氨基酸殘基(Ser13和Ser14)由于其側(cè)鏈所處位置的不同導(dǎo)致其對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)程度也不同;鹽橋在模型多肽結(jié)構(gòu)中本身穩(wěn)定性非常高，不易被突變所破壞.這些結(jié)果為理解模型多肽Trpcage折疊構(gòu)型的穩(wěn)定形成機(jī)制提供了重要的理論依據(jù).94

3.3 Trp-cage折疊過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的氨基酸

正是由于蛋白質(zhì)折疊問題的復(fù)雜性，很多研究者采用殘基定點突變的方法化解折疊問題的復(fù)雜性，對模型多肽Trp-cage結(jié)構(gòu)中一些關(guān)鍵殘基所形成的重要作用對其折疊動力學(xué)行為的影響進(jìn)行了大量的研究.即將每個點突變看作是探測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其動力學(xué)行為的探針，通過與野生天然態(tài)蛋白體系平衡狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和動力學(xué)特征數(shù)據(jù)對比，確定哪些殘基及其側(cè)鏈的相互作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊轉(zhuǎn)變產(chǎn)生重要影響.例如Andersen等71，92通過對Trp-cage的N9D和R16K突變體的研究發(fā)現(xiàn)，Asp9側(cè)鏈上的羧基與Arg16側(cè)鏈上胍基結(jié)合所形成的鹽橋?qū)rp-cage折疊態(tài)的穩(wěn)定性起到至關(guān)重要的作用;也有人通過殘基點突變的方法發(fā)現(xiàn)Trpcage結(jié)構(gòu)內(nèi)部殘基Ser14側(cè)鏈所形成的氫鍵作用對Trp-cage結(jié)構(gòu)的折疊形成具有重要的作用.92最近，She等95?97通過分子動力學(xué)方法發(fā)現(xiàn)四個疏水氨基酸殘基(Tyr3，Trp6，Leu7和Pro19)(如圖2所示)與Trp-cage的折疊動力學(xué)行為密切相關(guān)，并認(rèn)為這四個關(guān)鍵疏水殘基的相互作用主導(dǎo)著Trp-cage的整個折疊過程.基于這種疏水殘基在折疊過程中的重要作用，Gai等98設(shè)計了一個全新的多肽模型“Trp2-cage”(即Trp-cage的突變體P12W)(如圖1B所示)，表明Trp6/Trp12側(cè)鏈的疊合作用可極大地加速蛋白質(zhì)的折疊速率，使Trp2-cage的折疊過程可在1 μs范圍內(nèi)完成.

圖2 模型多肽Trp-cage的重要氨基酸95，96和“非重要氨基酸”94Fig.2 Four key residues95，96and other“non-key residues”94 in the Trp-cage mini-protein

通過上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管目前有很多實驗采用殘基點突變的方法研究蛋白質(zhì)折疊路徑，但實驗方面得到的數(shù)據(jù)并不能給出折疊路徑及其過渡態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)特征，71?78而現(xiàn)有模擬計算方面的殘基點突變幾乎都是針對模型多肽Trp-cage結(jié)構(gòu)中個別重要殘基位點，且僅是其它殘基的替換，通過分析比較不同殘基側(cè)鏈在同一位點上對其折疊過程的影響，得到很多關(guān)于模型多肽Trp-cage折疊機(jī)理方面的重要成果，同時進(jìn)一步驗證了構(gòu)成Trp-cage疏水籠結(jié)構(gòu)氨基酸對其整個結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和折疊動力學(xué)行為的主導(dǎo)重要性.79?84，95?98然而，除了已有文獻(xiàn)報道關(guān)注的關(guān)鍵氨基酸外，模型多肽中那些其它的“非重要”氨基酸殘基在我們以前殘基點突變對Trpcage折疊天然態(tài)構(gòu)型穩(wěn)定機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)它們對于結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定形成仍具有一定的特殊作用，并且其作用程度與它們側(cè)鏈位置及其穩(wěn)定性都存在緊密聯(lián)系(如圖2所示).94這些“非重要”氨基酸側(cè)鏈在模型多肽折疊過程中又是如何相互作用，對肽鏈的折疊完成發(fā)揮怎樣的效用等問題并沒有太多具體的報道，尤其是各個側(cè)鏈分子之間相互作用的協(xié)同效應(yīng)在折疊與解折疊過程中的作用依然不明確.或許這些問題的闡述對于全面理解Trp-cage折疊機(jī)制能夠提供重要理論依據(jù).相對于實驗技術(shù)條件來講，通過理論模擬計算研究在一定程度上能夠克服實驗上難以獲得結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)特征和實驗條件限制因素的制約.盡管現(xiàn)有的全原子水平分子動力學(xué)方法在模擬的時間尺度上仍然受到一定條件的限制，一些研究者努力通過調(diào)節(jié)溫度采用副本交換分子動力學(xué)(REMD)，12，99?102改變壓強(qiáng)，103?105添加變性劑，102，106，107施加額外機(jī)械力的拉伸分子動力學(xué)(SMD)108?112等方法以加速蛋白質(zhì)的折疊過程，進(jìn)而縮短模擬時間.但因這些方法是在非平衡狀態(tài)下模擬蛋白質(zhì)的動力學(xué)行為，有可能得不到真實的運(yùn)動軌跡，因此這嚴(yán)重限制了對蛋白質(zhì)動力學(xué)行為的理解.為此，我們在研究模型多肽Trp-cage、70，94微管活性肽段93，113，114和G蛋白結(jié)構(gòu)域(GB1)69的折疊形成過程中，基于不改變多肽和蛋白質(zhì)的折疊路徑，但能加快構(gòu)象轉(zhuǎn)化速率和跨域較高構(gòu)象能壘的思想，提出的一些新的模擬計算方法(例如溫控分子動力學(xué)方法根據(jù)肽鏈構(gòu)象轉(zhuǎn)變行為適時調(diào)溫可快速有效得到各個溫度梯度下構(gòu)象的穩(wěn)定的平衡態(tài)，清晰顯示肽鏈折疊轉(zhuǎn)變路徑;70，93距離限制性分子動力學(xué)方法結(jié)合原子力顯微鏡(AFM)拉伸實驗原理，通過逐步調(diào)控肽鏈兩端距離并固定肽鏈兩端原子分別進(jìn)行長程分子動力學(xué)模擬得到各個穩(wěn)定平衡態(tài)，清晰給出肽鏈從完全伸展態(tài)到天然折疊態(tài)轉(zhuǎn)變過程中的每個關(guān)鍵中間態(tài)與過渡態(tài)，并詳盡刻畫出整個折疊細(xì)節(jié)過程，69)不僅能夠有效研究蛋白質(zhì)或多肽在平衡狀態(tài)下的折疊動力學(xué)行為，而且可快速獲取有效、穩(wěn)定的中間態(tài)構(gòu)象以及過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，有效分解蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，給出一些實驗與常規(guī)模擬方法無法得到的折疊細(xì)節(jié)，為折疊機(jī)制提供直接、可靠的依據(jù).相信在未來計算硬件資源迅猛變革發(fā)展的同時，還會設(shè)計出更好的新算法加速蛋白質(zhì)折疊難題的破解.

4 結(jié)束語

蛋白質(zhì)天然態(tài)折疊結(jié)構(gòu)是其行使生物功能的生物物理基礎(chǔ)，搞清楚蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊機(jī)理對于理清結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系至關(guān)重要.蛋白質(zhì)肽鏈的折疊形成過程的驅(qū)動力主要取決于肽鏈上各個殘基之間的相互作用.因此，蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的研究問題中首要考慮的就是氨基酸的側(cè)鏈特性(如靜電、疏水、鹽橋、氫鍵、位阻等).迷你蛋白Trp-cage分子量小且結(jié)構(gòu)典型，目前是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊機(jī)理的良好模型多肽，哪些側(cè)鏈特性對其模型多肽Trpcage折疊過程有影響?對于具有影響肽鏈折疊的側(cè)鏈中，它們的影響比重又是如何分配?另外側(cè)鏈間所形成相互作用的協(xié)同性對折疊完成的影響又是怎樣?目前這些折疊細(xì)節(jié)的問題迫切要求我們能在未來的研究工作中提供能夠解決上述問題的思路，同時該問題解決的思路也能夠?qū)ξ覀兝斫獾鞍踪|(zhì)肽鏈折疊形成過程具有極大的促進(jìn)作用.

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