楊 丞，饒 翔，丁莉利，王明華

（1.海南醫(yī)學(xué)院病理教研室，海南?？?71101；2海南省海口市人民醫(yī)院病理科，海南海口570208）

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。近年有學(xué)者通過(guò)比較多種耐藥細(xì)胞系和其親本細(xì)胞系的形態(tài)和檢測(cè)EMT標(biāo)記性蛋白的表達(dá)，證實(shí)耐藥細(xì)胞株發(fā)生EMT改變，并使細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)［1］。但在化療藥物干預(yù)早期，EMT能否發(fā)生、發(fā)生的時(shí)間點(diǎn)及其與腫瘤細(xì)胞侵襲能力和耐藥性之間的關(guān)系等問(wèn)題，目前尚不清楚。本文通過(guò)體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，以低劑量短時(shí)間給藥處理，詳細(xì)觀察順鉑誘導(dǎo)低分化宮頸癌HCE1細(xì)胞株EMT的時(shí)間點(diǎn)及其與腫瘤細(xì)胞侵襲能力和耐藥性之間的關(guān)系，并明確Twist1是否為調(diào)控順鉑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人低分化宮頸癌HCE1細(xì)胞株購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。主要試劑：高糖亞甲基雙丙烯酰胺（dulbecco′s modified eagle′s medium，DMEM）培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，新生牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，胰蛋白酶和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)自Amersco公司，四甲基偶 氮 唑 鹽 （3－（4，5）－dimethylthiahiazo（－z－y1）－3，5－di－phenytetrazoliumromide，MTT）試劑購(gòu)自Sigma公司，Transwell小室購(gòu)自Corning Coster公司，基底膜Matrigel購(gòu)自BD Biosciences公司，順鉑（批號(hào)：H37021358）購(gòu)自山東齊魯制藥廠，相對(duì)分子質(zhì)量300.3Da。一抗抗體Vimentin、E－Cadherin、PGlycoprotein購(gòu)自ProMab公司。二抗羊抗鼠／兔抗體免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自邁新公司。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，cDNA Synthesis Kit購(gòu)自TOYOBO公司，PCR Master Mix（0.05units／uL Taq DNA Polymerase in reaction buffer，4 mmol MgCl2，0.4mmol dNTP）購(gòu)自 Fermentas公司，DNA Marker DL2000購(gòu)自TaKaRa公司，AGAROSE購(gòu)自AMRESCO公司，10×DNA上樣緩沖液購(gòu)自ProMab公司。PCR引物用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成。引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度如下：Twist上游引物：5′－GAG TCC GCA GTC TTA CGA G－3′，下 游 引 物：5′－ATC CTC CAG ACC GAG AAG－3′，長(zhǎng)度282bp；甘油醛－3－磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）上 游 引 物：5′－ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC －3′，下 游 引 物：5′－TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA－3′，長(zhǎng)度450bp。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)并形態(tài)觀察 以HCE1細(xì)胞株為對(duì)照組，加順鉑組（終濃度0.1mg／L）為實(shí)驗(yàn)組，分別以相同的細(xì)胞量接種到培養(yǎng)瓶，加入10%新生牛血清DMEM培養(yǎng)基置37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，分別于24、48、72、96h等以倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，比較細(xì)胞形態(tài)差異，尋找順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的時(shí)間點(diǎn)。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定方法 待以上細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰酶消化后重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在96孔板每孔加入100μL（104／mL）細(xì)胞，各設(shè)3個(gè)平行孔，置37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待24h后吸取實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液加入100μL含順鉑的培養(yǎng)液（終濃度0.1mg／L）。再過(guò)24h每孔加10μL MTT（5g／L），37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后棄上清液，每孔再加200μL DMSO，出現(xiàn)藍(lán)紫色顆粒結(jié)晶并充分溶解后于570nm處測(cè)光密度（OD）值，連續(xù)6d。然后以O(shè)D值為縱軸，時(shí)間為橫軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，比較生長(zhǎng)趨勢(shì)差異。

1.2.3 細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法 以HCE1細(xì)胞株為對(duì)照組，在EMT時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞為EMT組，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞玻片，D－Hank′s緩沖液清洗2次，于固定液固定10min，1×PBS緩沖液（0.01mol／L，pH 7.2）洗滌細(xì)胞片5min×3次，3%H2O2室溫孵育10min，再用1×PBS緩沖液洗滌5min×3次；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min，甩去多余液體，滴加一抗50μL，4℃過(guò)夜；1×PBS緩沖液洗滌5min×3次，滴加復(fù)合二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG），室溫靜置20 min，1×PBS洗滌5min×3次；二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色約4min，浸入自來(lái)水終止顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇分化1s，自來(lái)水沖洗15min，入乙醇脫水二甲苯透明；中性樹(shù)膠封片，鏡檢。比較兩組細(xì)胞陽(yáng)性染色差異。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)方法 用50mg／L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干；消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2遍，用含牛血清白蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5×104／mL；Transwell小室6孔板下室加入1mL含胎牛血清（Fetal calf serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)基，上室加入細(xì)胞懸液，每組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)細(xì)胞24h。用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，用95%乙醇固定15min，蘇木素染色10min，200倍光鏡視野下計(jì)數(shù)5個(gè)視野，計(jì)算平均細(xì)胞穿孔數(shù)。

1.2.5 半定量RT－PCR檢測(cè)Twist1表達(dá)方法 每組取107個(gè)細(xì)胞加入1mL Trizol試劑消化，室溫靜置5min后加入0.2 mL氯仿，震蕩15s后在4℃下12 000r／min離心15min，將水樣層轉(zhuǎn)移至干凈的試管，加入0.5mL異丙醇，混勻后－20℃下靜置15min，在4℃下12 000r／min離心10min，移去上層懸液，將RNA沉淀用1mL 75%乙醇洗滌，在振蕩器上混勻后4℃下7 500r／min離心5min，棄去上清液。適度干燥RNA沉淀后，加入適量0.1%焦磷酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水，使RNA完全溶解。2 000r／min離心20s。紫外吸收測(cè)定法測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，評(píng)估RNA純度。逆轉(zhuǎn)錄體系如下：總RNA 1μL，Oligo（dT）20（0.01mol／L）1μL，無(wú) RNase水10μL，5×RT Buffer 4μL，dNTP混合物（0.01mol／L）2μL，RNase抑制劑（10u／μL）1μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，在42℃反應(yīng)20min，99℃反應(yīng)5min，4℃反應(yīng)5min，即完成cDNA第一鏈合成。PCR反應(yīng)體系如下：cDNA模板1μL，引物（10μmol／L）1μL，PCR Master混合液（成分見(jiàn)材料）12.5μL，PCR緩沖液10.5μL，在95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。取8μL PCR產(chǎn)物加入2μL上樣緩沖液中于1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳（90v30min），用VDS凝膠成像儀攝影后進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算各擴(kuò)增產(chǎn)物與GADPH的比值。重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài) 分別于24、48、72、96h在顯微鏡下比較兩組細(xì)胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在72h發(fā)生EMT的形態(tài)改變：連接緊密的細(xì)胞變得扁平，更趨于梭形，且失去了大部分細(xì)胞連接（圖1）。72h即為HCE1發(fā)生EMT的時(shí)間點(diǎn)。

圖1 兩組72hHCE1細(xì)胞形態(tài)（倒置顯微鏡×100）

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)于72h前稍慢于對(duì)照組，72h后生長(zhǎng)趨勢(shì)逐漸與對(duì)照組接近，96h后兩組細(xì)胞均進(jìn)入平臺(tái)期，生長(zhǎng)趨勢(shì)基本重合，見(jiàn)圖2。

2.3 細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞黏附分子（E－cadharin）定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞間橋處，對(duì)照組高表達(dá)，EMT組表達(dá)減少；vimentin定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)處，對(duì)照組有表達(dá)，EMT組表達(dá)增加；P糖蛋白（P－gp）定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)處，對(duì)照組有表達(dá)，EMT組表達(dá)增加，見(jiàn)圖3。

2.4 腫瘤細(xì)胞侵襲結(jié)果 對(duì)照組HCE1細(xì)胞的平均穿膜細(xì)胞數(shù)為（39.000 0±2.828 4）個(gè)，EMT組HCE1的平均穿膜細(xì)胞數(shù)為（100.166 7±3.868 7）個(gè)，EMT組較對(duì)照組細(xì)胞多，侵襲能力EMT組強(qiáng)于對(duì)照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖2 宮頸癌細(xì)胞株HCE1MTT生長(zhǎng)曲線

圖3 兩組HCE1細(xì)胞標(biāo)志蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè)（SP法×200）

圖4 兩組HCE1細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)（倒置顯微鏡×200）

圖5 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.5 半定量RT－PCR檢測(cè)Twist1表達(dá) 對(duì)照組HCE1總RNA A260／A280為1.873 0，EMT組為1.904 0。對(duì)照組各條帶OD值與內(nèi)參OD比值為0.200 2±0.000 9，EMT組為0.615 6±0.005 1，EMT組Twist1表達(dá)比對(duì)照組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

3 討 論

EMT是胚胎發(fā)育中形態(tài)生發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程，以上皮細(xì)胞極性的喪失及間質(zhì)特性的獲得為重要特征，具體包括：細(xì)胞黏附分子（E－cadherin）表達(dá)減少；角蛋白為主的細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄐ蔚鞍诪橹鞯募?xì)胞骨架，從而引起細(xì)胞形態(tài)的改變［2］。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，宮頸癌HCE1細(xì)胞經(jīng)過(guò)低劑量順鉑處理72h可發(fā)生EMT的形態(tài)變化，上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E－cadherin表達(dá)減少、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)增強(qiáng)進(jìn)一步證明EMT的發(fā)生。從生長(zhǎng)曲線來(lái)看，生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)72h前實(shí)驗(yàn)組慢于對(duì)照組，提示順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的殺傷作用，引起細(xì)胞的凋亡，72h后生長(zhǎng)趨勢(shì)逐漸接近并與對(duì)照組重合，說(shuō)明順鉑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度會(huì)增快，因此，低劑量順鉑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT是一個(gè)早期事件。

順鉑是宮頸癌化療的一線藥物，但宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物獲得性耐藥是化療失敗的主要原因，尤其用小劑量化療藥物誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞，更易導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生［3］。近年研究表明，多藥耐藥基因1（multi－drug resistance gene 1，MDR－1）編碼的 P－gp的過(guò)表達(dá)與多藥耐藥（multi－drug resistance，MDR）發(fā)生有關(guān)［4］，而P－gp蛋白表達(dá)升高的腫瘤細(xì)胞具有增強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，提示化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥性和侵襲性增強(qiáng)之間存在內(nèi)在聯(lián)系［5－6］。最近的研究證實(shí)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、多藥耐藥還與EMT相關(guān)［7－8］。本實(shí)驗(yàn)顯示EMT組HCE1細(xì)胞體外侵襲能力增強(qiáng)，P－gp蛋白表達(dá)增強(qiáng)，也從細(xì)胞生物學(xué)特性上證實(shí)低劑量順鉑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞HCE1發(fā)生了EMT。從上可知化療藥物在治療早期誘導(dǎo)EMT是使宮頸癌化療失敗的關(guān)鍵性原因。因此，早期阻止EMT的發(fā)生，對(duì)防止形成耐藥性、降低轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)中順鉑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞HCE1發(fā)生EMT后，Twist1表達(dá)明顯高于EMT前，可以證實(shí)Twist1與宮頸癌細(xì)胞EMT的發(fā)生密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)順鉑誘導(dǎo)HCE1發(fā)生EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。而堿性螺旋－環(huán)－螺旋家族的轉(zhuǎn)錄因子Twist，已 被 證 實(shí) 在 胃 癌［9－10］、乳 腺 癌［11－12］、前 列 腺 癌［13］、肝癌［14］這些實(shí)體腫瘤存在過(guò)表達(dá)，Twist表達(dá)的升高還與腫瘤的分期、預(yù)后有關(guān)［15］。本研究結(jié)果提示，針對(duì)Twist的基因抑制在宮頸癌化療中可望產(chǎn)生協(xié)同作用，為提高臨床腫瘤化療效果提供一種新思路。

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